Design of synthetic oxygen consuming devices (OCDs) and their characterization in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: The F1F0 ATP synthase

Abstract

Cyanobacteria are a ubiquitous group of prokaryotes that perform oxygenic photosynthesis and many are also able to fix atmospheric nitrogen. These organisms may possess several enzymes involved in hydrogen metabolism: nitrogenase(s) catalyzing the production of molecular hydrogen along with the reduction of nitrogen to ammonia, an uptake hydrogenase involved in the consumption of the hydrogen produced by the nitrogenase, and a bidirectional hydrogenase with the ability to consume or produce hydrogen. This makes cyanobacteria good candidates for photobiological hydrogen production. Using cyanobacteria/cyanobacterial enzymes for hydrogen production faces a huge limitation which is the sensitivity of the enzymes to oxygen. One possible strategy to solve this problem is the use of oxygen consuming devices (OCDs) to create a microaerobic environment inside the cell. In this work, Synechocystis sp. PCC 6803 mutants, containing variants of the native ATP synthase, were generated in order to assess the feasibility of using variants of this enzyme as OCDs. The ATP synthase is the enzyme responsible for synthesizing most of the cellular ATP. It is known that the ATP/ADP ratio regulates the respiration rate; therefore impairing the activity of the ATP synthase should increase the oxygen consumption as a compensation for the decrease in the ATP/ADP ratio. The results obtained for the βI179A mutant, with a mutated β subunit of the ATP synthase, show a significant increase in oxygen consumption compared to the wild type, suggesting that this variant of the ATP synthase might be a good OCD. Other variants of the ATP synthase were generated in this work but have not yet been characterized.

As cianobactérias são um amplo grupo de procariotas que são capazes de realizar fotossíntese com libertação de oxigénio, muitas são também capazes de fixar azoto atmosférico. Estas bactérias possuem várias enzimas envolvidas no metabolismo do hidrogénio: nitrogenase(s) que produzem hidrogénio durante a fixação de azoto atmosférico, a hidrogenase de assimilação que está envolvida no consumo do hidrogénio produzido pela nitrogenase e a hidrogenase bidireccional que tem a capacidade de consumir ou produzir hidrogénio. Estas características fazem das cianobactérias excelentes candidatas para a produção fotobiológica de hidrogénio. O uso das cianobactérias ou das suas enzimas para a produção de hidrogénio apresenta uma grande limitação que é a sensibilidade destas enzimas ao oxigénio. Uma das possíveis estratégias para a resolução deste problema é o uso de módulos de consumo de oxigénio (OCDs – Oxygen Consuming Devices) de forma a criar um ambiente microaeróbico no interior da célula. Neste trabalho geraram-­‐se mutantes de Synechocystis sp. PCC 6803 com variantes da ATP sintase com o objectivo de testar a possibilidade de usar estas variantes da enzima como OCDs. A ATP sintase é a enzima responsável pela síntese da maior parte do ATP intracelular. Sabe-­‐se que o rácio ATP/ADP regula a taxa respiratória. Assim diminuindo a actividade da ATP sintase deverá aumentar a taxa respiratória de forma a compensar o decréscimo do rácio ATP/ADP. Os resultados obtidos para o mutante βI179A, com uma mutação na subunidade β da ATP sintase, mostram um aumento significativo do consumo de oxigénio comparativamenta à estirpe selvagem, sugerindo que esta variante poderá ser utilizada como OCD. Durante este trabalho geraram-­‐se mutantes com outras variantes da ATP sintase mas estes ainda não estão completamente segregados não foi possível fazer a caracterização.