Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/24725
Title: Interaction between ecto-5’-nucleotidase and adenosine A2A receptors in nerve terminals of mice prefrontal cortex
Authors: Silva, Tiago Soares 
Orientador: Agostinho, Paula
Tomé, Ângelo
Keywords: Ecto-5’-nucleotidase; Córtex pré-frontal; Transmissão sináptica; Receptores de adenosina; Terminais nervosos
Issue Date: 2013
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A ativação dos recetores de adenosina A2A (A2AR) é feita através da adenosina que pode ser produzida através do catabolismo do ATP libertado no meio extracelular. A ecto-5’-nucleotidase (e-5’N) desempenha um papel importante na formação de adenosina proveniente do catabolismo do ATP, e subsequentemente na ativação dos A2AR controlando assim a plasticidade sináptica. Após uma lesão cerebral, o ATP é libertado como um sinal aversivo provocando o aumento em simultâneo da atividade da e-5’N e da densidade dos A2AR. Isto levanta a hipótese de que a e-5’N e os A2AR podem encontrar-se co-localizados e poderá haver uma interação funcional entre eles. Este estudo tem como objetivos definir: i) a localização sináptica e sub-sináptica (regiões pré-, pós- e extra-sinápticas) da e-5’N focando principalmente no córtex pré-frontal (PFC) de ratinhos C57Bl/6 adultos, ii) a co-localização da e-5’N com os A2AR em fatias do PFC e em terminais nervosos corticais, iii) se a deleção genética dos A2AR afeta a densidade sináptica da e-5’N em regiões corticais, iv) a função da e-5’N na plasticidade sináptica do PFC, e por fim, v) se o envelhecimento afeta a densidade sináptica da e-5’N em regiões do PFC. A comparação por análise de Western blot da densidade da e-5’N em membranas totais e sinaptossomas do córtex pré-frontal revelou que a e-5’N se encontrava nos terminais nervosos (52.1  2.3%, n=4), mas não se encontrava tão enriquecida como nas membranas totais (72.5  3.1%, n=4). O fracionamento dos sinaptossomas do córtex pré-frontal mostrou a presença de duas isoformas diferentes da e-5’N, estando uma mais presente nas frações pré-sináptica e extra-sináptica (~50 kDa) e outra presente (~70 kDa) na fração pós-sináptica. Através de imunohistoquímica foi possível verificar uma aparente co-localização entre a e-5’N e os A2AR, estando mais presentes em neurónios e microglia, mas não com astrócitos. O “pull-down” dos A2AR em terminais nervosos do córtex pré-frontal revelou uma associação física entre os A2AR e a e-5’-N. A delecção genética dos A2AR não afetou significativamente os níveis de e-5’-N, no entanto verificou-se um ligeiro aumento nos níveis desta enzima. Estudos de eletrofisiologia em fatias de córtex pré-frontal incubadas com um antagonista seletivo dos A2AR (SCH 58261) demonstraram que a ativação dos A2AR era necessária para obter potenciação de longa duração (LTP); porém quando a e-5’N era inibida (com AOPCP), prevenindo a formação de adenosina, a transmissão sináptica basal sofria um efeito inibitório mas não se observaram diferenças significativas no fenómeno da LTP, desencadeado por 5 “trains” de estímulos de 300 Hz. Também foram avaliados através de HPLC os níveis basais de AMP e adenosina em sinaptossomas de córtex pré-frontal, e como esperado observou-se níveis aumentados de AMP na presença de AOPCP, uma vez que este nucleósido não estava a ser convertido em adenosina, no entanto os níveis de adenosina não se encontravam alterados significativamente; o que sugere que a contribuição da e-5’N para a formação de adenosina nos terminais nervosos do PFC não é significativa. Finalmente, analisou-se se a densidade sináptica da e-5’N era afetada pelo envelhecimento, para tal comparámos por imunoblot a densidade desta enzima em ratinhos jovens adultos (8-12 semanas de idade) e em ratinhos adultos (36-40 semanas de idade); porém, não se observaram diferenças significativas entre estes dois grupos de animais. Embora este trabalho tenha algumas questões que precisam de ser detalhadas com mais rigor, os resultados contribuem com novos dados sobre a relação entre a e-5’N e os A2AR no PFC, e poderão ser úteis para resolver questões relacionadas com disfunções do lobo frontal do cérebro.
The activation of adenosine A2A receptors (A2AR) is mediated by adenosine that can be originated from the extracellular catabolism of released ATP. Ecto-5’-nucleotidase (e-5’N) plays a key role in the formation of ATP-derived adenosine and in the subsequent activation of A2AR to control synaptic plasticity. Upon brain injury, ATP is released as a stress signal and both e-5’N and A2AR are up-regulated in parallel. This prompts the hypothesis that e-5’N and A2AR could be co-localized and co-regulated. The present study aims to define: i) the synaptic and sub-synaptic (pre-, post- and extra-synaptic regions) localization of e-5’N focusing in the prefrontal cortex (PFC) of adult C57Bl/6 mice, ii) the co-localization of e-5’N with A2AR in slices from the PFC and in cortical nerve terminals, iii) if the genetic deletion of A2AR affects the density of synaptic e-5’N in cortical regions, iv) the function of e-5’N in synaptic plasticity in the PFC, and finally v) if aging affects the density of synaptic e-5’N in PFC regions. The comparison by Western blot analysis of the density of e-5’N in prefrontal cortex total membranes and synaptosomes revealed that e-5’N, was present in nerve terminals (52.1  2.3%, n=4), but was not as enriched as in the bulk of total membranes (72.5  3.1%, n=4). The fractionation of prefrontal cortex synaptosomes unveiled the presence of two different isoforms of e-5’N, one being more present at the pre-synaptic and extra-synaptic fractions (~50 kDa) and the other (~70 kDa) at the post-synaptic fraction. By immunohistochemistry it was possible to observe an apparent co-localization of e-5’N with A2AR, mainly associated with neurons and microglia but not with astrocytes. The pull-down of A2AR revealed a physical association of A2AR with e-5’-N in nerve terminals from the prefrontal cortex. The genetic deletion of A2AR did not affect significantly the levels of e-5’-N, although it was found a slight increase in the levels of this enzyme. Electrophysiological studies in prefrontal cortex slices incubated with a selective antagonist of A2AR (SCH 58261) demonstrated that the activation of A2AR was necessary to obtain long term potentiation (LTP); however when e-5’N was blocked (with AOPCP), and consequently the adenosine formation was prevented, the basal synaptic transmission suffered an inhibitory effect but there were no significant changes in the LTP phenomenon, triggered by 5 trains of 300 Hz stimuli. We also evaluated by HPLC measurements the basal levels of AMP and adenosine in synaptosomes from the PFC and as expected it was observed that in the presence of AOPCP, the levels of AMP were increased, since this nucleoside was not converted into adenosine, nevertheless the levels of adenosine did not change significantly; suggesting that the contribution of e-5’N to adenosine formation in nerve terminals of PFC was not substantial. Finally we analysed whether the synaptic density of e-5’N was affected by the aging, thus we compared by immunoblot the density of this enzyme in young adult (8-12 weeks old) and in adult mice (36-40 weeks old); nevertheless, no significant differences were observed between these two groups of animals Although this work have some question that need to be more deeply investigated, the results give new insights about the relation between e-5’N and A2AR in the PFC, and could be useful to tackle questions regarding frontal lobe brain dysfunctions.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/24725
Rights: openAccess
Appears in Collections:UC - Dissertações de Mestrado
FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

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