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https://hdl.handle.net/10316/24664
Title: | A Chloroplastidial Atypical Aspartic Protease from Arabidopsis thaliana:Optimization of Heterologous Expression, Purification and Biochemical Characterization | Authors: | Pedroso, Daniela Patrícia Martins Dias | Orientador: | Pires, Euclides Simões, Isaura |
Keywords: | Plant aspartic proteases; proteaseAtypical aspartic proteases; Chloroplast; Arabidopsis thaliana | Issue Date: | 2013 | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | As proteases aspárticas estão amplamente distribuídas por todos os reinos biológicos.
O reino das plantas apresenta um número mais elevado de proteases aspárticas do
que os restantes reinos biológicos, o que sugere que estas possam ter um papel
importante nos seus processos biológicos.
As proteases aspárticas atípicas de plantas possuem características únicas. Apresentam
uma organização muito diferente da sua estrutura primária (não possuem o domínio
PSI), possuem um elevado conteúdo em cisteínas e uma sequência de aminoácidos
única à volta da primeira tríade catalítica (hidrofóbico-hidrofóbico-DTG-serina-acídico).
Estas proteases têm localizações celulares pouco usuais e vários autores afirmam que
estas enzimas possuem uma função especializada, estando envolvidas em processos
altamente regulados.
A NP_181826 (At2g42980) é uma protease aspártica atípica cloroplastidial de
Arabidopsis thaliana. Esta protease possui um domínio de ligação a DNA, o que sugere
que o DNA poderá ter um efeito de regulação da actividade da protease. Esta protease
também apresenta uma presequência bipartida. Este tipo de presequência só foi
descrito em organismos que sofreram um processo de endossimbiose duplo, sendo
que nunca foi encontrada em plantas superiores como a Arabidopsis thaliana.
As suas características únicas e o facto de se encontrar no cloroplasto sugerem que
esta protease aspártica possa ter um papel extremamente importante neste organelo.
O objectivo deste trabalho consistiu em estabelecer e optimizar protocolos de
expressão e purificação para a produção da NP_181826, usando E.coli como sistema
heterólogo de expressão. Neste estudo, uma putativa forma madura da NP_181826
(35toDTG) foi clonada e expressa neste sistema.
Várias estratégias foram utilizadas para optimizar a sua expressão e purificação.
Quando expressa na forma solúvel, a forma recombinante 35toDTG apresentou
tendência para ser co-purificada com outras proteínas e a quantidade de proteína
obtida foi muito baixa. A expressão na forma de corpos de inclusão seguida de um processo de refolding por diálise resultou na melhor estratégia para obter quantidades
elevadas de proteína purificada.
A proteína recombinante 35toDTG apresentou actividade proteolítica contra o
substrato típico das protease aspárticas, com um pH óptimo a 3.5. Esta protease
aparenta ter uma especificidade muito restrita, sendo capaz de cortar a cadeia β
oxidada da insulina em apenas um local. A sua completa inibição na presença de
Pepstatina A e a perda total de actividade do seu mutante do local activo colocam esta
protease na família A1 das proteases aspárticas. A inibição com DTT e GSH, não
havendo qualquer inibição com GSSG, e o efeito de activação por parte do NADH e
ADT levam a concluir que o ambiente redox e a presença de nucleótidos podem
influenciar directamente a estabilidade e/ou actividade catalítica desta protease
aspártica atípica.
Os resultados experimentais sugerem que a NP_181826 poderá ter uma função
altamente específica no cloroplasto da Arabidopsis e que o ambiente redox do
cloroplasto poderá influenciar directamente a sua actividade proteolítica. Aspartic proteases are widely distributed among all the biological kingdoms. Plants have a higher number of aspartic proteases, suggesting that in these organisms aspartic proteases may play an important role in different biological processes. Plant atypical aspartic proteases have very unique characteristics. They present a very different domain organization in its primary structure (loss of the PSI domain), a higher number of cysteine residues and a unique amino acid sequence around the first catalytic triad (hydrophobic-hydrophobic-DTG-Serine-Acid). These proteases were found in very unusual localizations and several authors claim that they have specialized functions and are involved in highly regulated processes. NP_181826 (At2g42980) is a chloroplastidial atypical aspartic protease from Arabidopsis thaliana. This protease has a putative DNA-binding domain, suggesting that DNA may have a regulatory influence in its catalytic activity. Also, a bipartite presequence is present in NP_181826 primary sequence. These bipartite presequences were only found so far in organisms that experienced a secondary endosymbiosis and they were never described in superior plants, such as Arabidopsis. The chloroplastidial localization and its unusual sequence features suggest that this aspartic protease may have a critical role in the biological system. The aim of this study was to establish and optimize an expression and purification protocol for production of NP_181826, using E. coli as the heterologous host. A putative mature form of NP_181826 (35toDTG) was cloned and expressed in this system. Several approaches were used to optimize 35toDTG expression and purification. When expressed as soluble protein, 35toDTG was shown to co-purify with several other proteins and the protein yields were always very low. Expression as inclusion bodies followed by refolding by dialysis was the best strategy to obtain a higher yield of purified protein. Recombinant 35toDTG showed proteolytic activity towards a typical aspartic protease substrate, at an optimum pH value of 3.5. This protease showed a very restricted specificity, being able to cleave oxidized insulin β-chain in only one site. Its complete 6 inhibition in the presence of Pepstatin A and the total loss of proteolytic activity observed for the active-site mutant, positions NP_181826 in the A1 family of aspartic proteases. The inhibition effect of DTT and GSH, with no effect in the presence of GSSG, and NADH and ATP activation effect in 35toDTG proteolytic activity suggest that the redox environment and the presence of nucleotide species can have a direct effect on the stability and/or catalytic activity of this atypical aspartic protease. These experimental evidences strongly suggest that NP_181826 may have a very specific function in Arabidopsis’s chloroplast and that the redox environment of the chloroplast may have a direct influence on the protease activity. |
Description: | Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. | URI: | https://hdl.handle.net/10316/24664 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | UC - Dissertações de Mestrado FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado |
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