Avaliação Microestrutural da Córnea por Microscopia Confocal IN VIVO

Abstract

O conhecimento da microanatomia da córnea é essencial para entendimento da patologia corneana, uma vez que a organização da matriz extracelular e das células é o factor mais determinante das suas propriedades ópticas e mecânicas. O conhecimento da complexidade da microanatomia da córnea requer a utilização de diversos métodos. A microscopia confocal in vivo da córnea é um método rápido e fidedigno de avaliação da microestrutura corneana in vivo. Neste trabalho, demonstrámos que, sendo um método não invasivo com resultados em tempo real, permite-nos avaliações quantitativas a nível histológico dos diferentes componentes celulares corneanos, quer na córnea normal quer na córnea com patologia. Desde os nossos primeiros trabalhos em 2001, com o microscópio confocal Tomey ConfoScan P4, que ponderámos o imenso potencial das imagens obtidas e desde logo procurámos saber se a microscopia confocal da córnea in vivo poderia observar as estruturas corneanas em tempo real e com detalhe histológico. Numa primeira fase quantificámos elementos celulares e nervos corneanos e validámos os resultados, de acordo metodologias bem precisas e que documentámos. Nestes estudos comparámos os resultados obtidos em imagens de microscopia confocal da córnea in vivo de botões corneanos de cadáver com as imagens histológicas dos mesmos botões que entretanto haviam sido corados com hematoxilina-eosina e verificámos a correspondência das densidades celulares calculadas nas seis camadas corneanas. Para avaliação da precisão da técnica, determinámos as repetibilidades intra-sessão e inter-sessão. Realizámos ainda um estudo comparativo das densidades celulares de diferentes camadas da córnea entre diabéticos e controlos saudáveis. Neste estudo demonstrámos que, nos diabéticos, a densidade de células basais epiteliais é significativamente inferior à observada nos indivíduos saudáveis, o que pode contribuir de uma forma significativa para o surgimento da queratopatia diabética. Uma vez demonstrada a exactidão, a precisão e capacidade e observação fidedigna da microanatomia corneana, aplicámos a microscopia confocal da córnea no estudo clínico de diferentes patologias como a queratite por acantamoeba, insuficiência límbica, PAF tipo 1 autotransplante de conjuntiva, transplantes de córnea, cirurgia refractiva, cistinose entre outras. Confirmou-se que a microscopia confocal da córnea in vivo é um auxiliar valioso no diagnóstico precoce na queratite por acantamoeba. Quantificámos palissadas de Vogt na insuficiência límbica e obtivemos imagens compatíveis com as criptas límbicas e as projecções focais estromais, tanto na microscopia confocal da córnea in vivo como na histologia. Tal permitiu-nos assegurar que não ocorre falência límbica na zona dadora quando realizamos autotransplante límbico para o tratamento do pterigium. Quantificámos os cristais de cistina na córnea de doentes com cistinose e concluímos que o tratamento com colírio de cesteamina é eficaz nestes doentes. Desta forma, verificámos a capacidade da microscopia confocal da córnea para avaliar a eficácia de terapias ao longo do tempo, algo que só é possível devido à reprodutibilidade da técnica. Assim, os estudos que realizámos, demonstraram que a microscopia confocal da córnea permite visualizar e quantificar in vivo os elementos da microanatomia corneana, com exactidão validada pela histologia e de forma reprodutível, permitindo avaliações prospectivas.

The cornea microanatomy knowledge is essential to understand corneal pathology, since the organization of the extracellular matrix and cells is the most crucial factor of its optical and mechanical properties. Understanding the complexity of the corneal microanatomy requires the use of several methods. In vivo corneal confocal microscopy is a rapid and reliable assessment of the corneal microstructure in vivo. In this work we demonstrated that, being a non-invasive method with real-time results, it allows us histological quantitative evaluations of the different corneal cellular components, either in the normal or in the diseased cornea. Since our first work in 2001, with the Tomey ConfoScan P4 confocal microscope, we understood the enormous potential of the images we could obtain and immediately tried to find out if in vivo corneal confocal microscopy could analyze the corneal structures in real time and with histological detail. Initially we quantified the cellular elements and corneal nerves and we validated the results obtained according to very precise methodologies, which we documented. In these studies we compared the results obtained by in vivo corneal confocal microscopy images of cadaver corneal buttons to histological images of the same buttons stained with hematoxylineosin and found correspondence of the cell densities in six corneal layers. To evaluate the accuracy of the technique, we determined the intra and inter-session repeatabilities. We still performed a comparative study of the cellular densities of the different corneal layers in diabetic patients and healthy controls. In this study we showed that in diabetic patients the density of epithelial basal cells is significantly lower than in healthy subjects which may well contribute to the emergence of diabetic keratopathy. Once we demonstrated the accuracy, precision, capacity and reliable observation of the corneal microanatomy, we used the corneal confocal microscopy in the clinical study of different pathologies such as acanthamoeba keratitis, limbal stem cell deficiency, PAF type 1, conjunctival autograft, corneal transplant, refractive surgery, cystinosis, among others. We confirmed that in vivo corneal confocal microscopy is a valuable tool in the acanthamoeba keratitis early diagnosis. We quantified palisades of Vogt in limbal failure and obtained images compatible with limbal crypts and focal stromal projections either in in vivo corneal confocal microscopy or in histology. This allowed us to ensure that no limbal stem cell deficiency occurs in the donor area when we perform the limbal auto graft for the treatment of pterygium. We quantified the cystine crystals in the cornea of cystinosis patients and concluded that the treatment with cysteamine eyedrops is effective in these patients. Thus we verified the ability of in vivo corneal confocal microscopy to evaluate the efficacy of therapies over time, which is only possible due to the technique reproducibility. Thus, the studies we have performed, demonstrate that corneal confocal microscopy allows to visualize and quantify in vivo the elements of corneal microanatomy, with accuracy validated by histology and in a reproducible manner, allowing prospective evaluations.