MicroRNAs as molecular targets for non-viral gene therapy of glioblastoma: development of a lipid-based nanosystem for nucleic acid delivery to brain tumor cells

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor associated with a high degree of mortality. Despite the recent advances in cancer therapy, GBM almost always recurs and patient survival remains under the year mark, thus emphasizing the need for new and effective therapeutic strategies, as well as a better understanding of the molecular alterations that occur in this malignancy. The development of successful GBM therapies faces two major challenges. The first concerns the identification of cellular effectors involved in cancer surgence and progression, which may constitute important targets for an effective therapeutic approach. MicroRNAs (miRNAs), a small class of noncoding gene-regulator RNAs, have been implicated in the intricate carcinogenic process, including GBM pathogenesis. In this regard, the modulation of dysregulated miRNAs has been associated with anti-tumor activities, including reduced cell proliferation and increased apoptosis, which indicates that miRNAs could be explored as targets for treatment of cancer. The second major challenge relates to the delivery of the therapeutic molecules to the brain tumor cells. The complex structure of the blood-brain barrier (BBB) strongly restricts the type and amount of molecules that can reach the brain. Therefore, development of safe and efficient delivery systems, able to surpass the BBB and improve the delivery of anti-tumoral agents to the brain, could significantly contribute to increase the efficacy of GBM therapies. Aiming at generating an effective therapy to GBM with clinical relevance, one of the main purposes of this Thesis consisted in the development of a non-viral gene therapy approach towards GBM, based on stable nucleic acid lipid particles (SNALPs), which were designed for systemic delivery of antisense oligonucleotides (ASOs) targeting dysregulated miRNAs in GBM. Initial studies, described in Chapter 3, involved the identification of abnormally expressed miRNAs in GBM through real-time PCR quantification of miRNAs in tumor samples from patients and GBM mouse models, and control non-cancer tissues. MicroRNA-21 (miR-21) was found to be upregulated and microRNA-128 (miR-128) was downregulated in tumor samples, when compared to their expression in different control tissues, a finding that was corroborated by the analysis of a large set of human GBM data from The Cancer Genome Atlas. The therapeutical potential of a miRNA-based approach was evaluated by assessing the cellular and molecular alterations associated with the repression of miR-21, by Western blot, apoptosis and cell viability assays. A significant increase in both the expression of tumor suppressors PTEN and PDCD4 and the activation of apoptose effectors caspase 3/7 were observed in cells with reduced miR-21 expression. Importantly, miR-21 silencing enhanced the cytotoxic effect of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib, whereas no therapeutic benefit was observed when combining miR-21 silencing with the first line drug temozolomide. The second part of this Work, described in Chapter 4, was focused on the development and application of a lipid-based nanosystem - SNALPs - for targeted delivery of nucleic acids to GBM. To achieve specific tumor delivery, as well as to enhance particle internalization, the peptide chlorotoxin (CTX), which was reported to bind selectively to glioma cells while showing no affinity for non-cancer cells, was covalently coupled to the liposomal surface. Initial studies, addressing the physicochemical characteristics of the developed nanoparticles, revealed that the targeted (CTX-coupled) SNALPs exhibit suitable features for in vivo application, including small size (below 180 nm) and neutral surface charge. Moreover, high ASO-encapsulation efficiencies were obtained for both targeted and nontargeted formulations. Cellular association (flow cytometry) and internalization (confocal microscopy) studies revealed that CTX coupling onto the liposomal surface enhanced SNALP internalization into glioma cells, while no significant internalization was observed in non-cancer cells. Importantly, CTX was also shown to enhance particle internalization into established intracranial tumors. Furthermore, increased expression of PTEN and PDCD4, caspase 3/7 activation and increased tumor cell sensitivity to sunitinib were observed in U87 human GBM and GL261 mouse glioma cells when incubated with CTX-coupled liposomes encapsulating anti-miR-21 oligonucleotides. Finally, in Chapter 5, the effect of the angiogenic platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) on the expression of miRNAs in GBM was investigated, aiming at understanding its role in GBM tumorogenesis. Initial studies demonstrated that miR-21 and miR-128 were downregulated in U87 cells overexpressing PDGF-B (U87-PDGF), which was associated with increased cell proliferation. Curiously, siRNA-mediated PDGF-B silencing led to increased levels of miR-21 and miR-128, whereas miR-21 overexpression did not affect the expression of PDGF-B. Microarray analysis was performed to ascertain whether the expression profiling of other miRNAs would be affected by the exposure to increased levels of PDGF-B. In this regard, increased expression of pro-oncogenic miRNAs (including members of the miR-106b family) and decreased expression of tumor suppressor miRNAs (including let-7b) were observed in U87-PDGF cells. Overall, the findings gathered in this Work demonstrate the therapeutic relevance of a multimodal approach towards GBM, combining targeted and efficient delivery of anti-miRNA oligonucleotides, via CTX-coupled SNALPs, with the receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib, with potential to be successfully applied in future clinical translational studies.

O glioblastoma (GBM) é o tipo de tumor cerebral mais comum e mais agressivo que afecta os humanos. Apesar dos recentes avanços no estudo do cancro, as opções de tratamento para este tipo de tumor permanecem limitadas e pouco eficazes, com taxas de sobrevivência de 9 a 12 meses após diagnóstico. Assim, é urgente desenvolver novas estratégias terapêuticas que conduzam à morte das células tumorais e à erradicação do tumor, aumentando assim a esperança de vida dos doentes. O desenvolvimento de abordagens terapêuticas para tratamento do GBM apresenta dois grandes desafios. O primeiro está relacionado com a identificação de moléculas efectoras envolvidas no aparecimento e desenvolvimento do GBM, que poderão constituir alvos importantes para uma eficaz abordagem terapêutica. Inúmeros estudos demonstraram que microRNAs (miRNAs), uma classe de pequenas moléculas de RNA não codificante com capacidade de regular a expressão genética, estão envolvidos no processo carcinogénico, incluindo o desenvolvimento do GBM. Para além disso, vários estudos demonstraram que a modulação de miRNAs expressos em níveis anormais nas células tumorais resulta em actividade anti-tumoral, incluindo a redução da proliferação celular e o aumento da apoptose, o que indica que os miRNAs poderão ser explorados como alvos numa terapia anti-cancerígena. O segundo grande desafio está relacionado com a entrega de agentes anti-cancerígenos ás células tumorais cerebrais. A complexa estrutura da barreira hematoencefálica restringe drasticamente o tipo e quantidade de moléculas que podem alcançar o tecido cerebral. Assim sendo, o desenvolvimento de veículos que possam ultrapassar esta barreira e entregar de forma segura e eficiente agentes terapêuticos às células tumorais cerebrais poderá contribuir para o aumento de eficácia das terapias direccionadas ao GBM. Com o objectivo de gerar uma terapia eficaz para GBM, com relevância clínica, um dos principais objectivos desta Tese consistiu no desenvolvimento de uma estratégia de terapia génica não viral, baseada em partículas lipídicas estáveis encapsulando ácidos nucleícos (SNALPs), que foram concebidas para entrega sistémica de oligonucleótideos antisense direccionados para miRNAs desregulados em GBM. Estudos iniciais, descritos no Capítulo 3, envolveram a identificação de miRNAs anormalmente expressos em GBM, através da quantificação por PCR em tempo real de miRNAs em amostras tumorais de doentes e modelos animais de GBM, e em diferentes amostras de tecido não tumoral. Os resultados obtidos demonstraram que o microRNA-21 (miR-21) se encontra sobre-expresso e o microRNA-128 (miR-128) se encontra sobexpresso nas amostras tumorais, quando comparado com os níveis de expressão em amostras não tumorais. A análise de dados relativos a aproximadamente 200 amostras de GBM, disponíveis na base de dados TCGA (The Cancer Genome Atlas, USA), corroborou os resultados obtidos. Para avaliar o potencial de uma abordagem terapêutica baseada em miRNAs, oligonucleótideos antisense foram utilizados para silenciar o miR-21 em células de GBM em cultura. Ensaios para detectar a expressão de proteínas (Western blot), activação de apoptose e viabilidade celular foram realizados para avaliar as alterações celulares e moleculares associadas à repressão do miR-21. Um aumento significativo da expressão dos supressores tumorais PTEN e PDCD4 e a activação dos efectores apoptóticos caspase 3/7 foram detectados em células com níveis baixos de miR-21. Importantemente, o silenciamento do miR-21 aumentou o efeito citotóxico do sunitinib, um inibidor de receptores com actividade de cinase de tirosina, enquanto que nenhum benefício terapêutico foi observado quando o silenciamento do miR-21 foi combinado com temozolomide, o fármaco que é actualmente utilizado no tratamento do GBM. A segunda parte deste trabalho, descrita no Capítulo 4, focou-se no desenvolvimento e aplicação de nanopartículas de base lipídica – SNALPs – para a entrega direccionada de oligonucleótideos antisense contra o miR-21. De forma a entregar os oligonucleótidos de forma específica às células tumorais e aumentar a internalização das nanopartículas, clorotoxina (CTX), um peptídeo que se liga especificamente a células tumorais e que revela baixa afinidade para células não tumorais, foi ligado covalentemente à superfície das nanopartículas. Estudos iniciais avaliaram as características fisico-químicas das nanopartículas desenvolvidas e revelaram que estas possuem características ideais para administração in vivo, incluindo tamanho reduzido (inferior a 180 nm) e carga superficial neutra. Para além disso, uma elevada taxa de encapsulação de oligonucleótideos foi obtida para as nanopartículas com e sem CTX associada. Estudos de associação (citometria de fluxo) e internalização celular (microscopia confocal) revelaram que o acoplamento de CTX à superfície das nanopartículas permitiu o aumento da sua internalização em células de GBM, enquanto que reduzida internalização foi detectada em células não cancerígenas. Importantemente, a associação de CTX ás nanopartículas permitiu também aumentar a internalização destas em tumores de murganho, desenvolvidos após implantação intracraniana de células de glioma. Um aumento significativo da expressão dos supressores tumorais PTEN e PDCD4, activação das caspases 3 e 7 e aumento da citotoxicidade do sunitinib foram também detectados após exposição de células de GBM humano (U87) e glioma de murganho (GL261) a nanopartículas com clorotoxina encapsulando oligunucleótideos contra o miR-21. Na última parte deste Trabalho, descrita no Capítulo 5, o efeito do factor de crescimento angiogénico derivado de plaquetas B (PDGF-B), na expressão de miRNAs em GBM, foi investigado com o objectivo de compreender o seu papel na carcinógenese do GBM. Estudos iniciais demonstraram que o miR-21 e o miR-128 estão sob-expressos em células U87 que sobre-expressam PDGF-B (U87-PDGF), estando esta sob-expressão dos miRNAs associada a um aumento da proliferação celular. Curiosamente, o silenciamento do PDGF-B, via siRNAs, resultou num aumento da expressão do miR-21 e do miR-128, enquanto que a sobre-expressão do miR-21, mediada por plasmídeos, não afectou significamente os níveis de PDGF-B. Importantemente, a quantificação de miRNAs utilizando miRNA “arrays” revelou que vários miRNAs pró-oncogénicos, incluindo membros da família do miR-106b, estão sobre-expressos em células U87-PDGF, enquanto que vários miRNAs com funções de supressão tumoral, incluíndo let-7b, estão sob-expressos nestas células. Em conclusão, os resultados apresentados nesta Tese demonstram a relevância terapêutica de uma abordagem multi-modal direccionada a GBM, combinando um nanosistema de base lipídica para entrega específica e eficiente de oligonucleótideos antisense contra miRNAs com o fármaco sunitinib, com potencial para ser aplicada em estudos clínicos.