Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/10316/23791
Título: Stress, Depression and Adrenal Gland: An Insight Into the Adrenal Medullary Catecholaminergic System
Autor: Santana, Magda Matos 
Orientador: Cavadas, Cláudia Margarida Gonçalves
Ehrhart-Bornstein, Monika
Data: 26-Jul-2013
Citação: SANTANA, Magda Matos - Stress, depression and adrenal gland : an insight into the adrenal medullary catecholaminergic system. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento
Resumo: The adrenal gland is the primary peripheral organ involved in stress response and catecholamines, released from the adrenal medulla, are major mediators of several physiological changes necessary to maintain homeostasis. However, prolonged and/or repetitive stress could lead to adaptive responses, including in the adrenal medulla, which may contribute to the development of diseases, such depression and cardiovascular disease. To understand the pathophysiology of stress-related disorders, and particularly the linking mechanisms between depression and cardiovascular disease that might underlie the elevated co-morbidity of these two diseases, the adrenal medullary catecholaminergic system was studied in a mouse model of depression induced by unpredictable chronic stressor exposures. Mice were submitted to 7 or 21 days of unpredictable chronic stress (UCS) and the chromaffin granule content [neuropeptide Y (NPY) and chromogranin A (CgA)], catecholamine biosynthetic enzymes [tyrosine hydroxylase (TH) dopamine-β-hydroxylase (DβH) and phenylethanolamine-N-methyltransferase (PNMT)], catecholamine transporters [norepinephrine transporter (NET), vesicular monoamine transporter 1 and 2 (VMAT1 and VMAT2)], exocytotic machinery [synaptosomal-associated protein 25, (SNAP25), Syntaxin1A, vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP2) and synaptophysin) and gap junctional communication [connexin 36 (Cx36), connexin 43 (Cx43) and zonula occudens-1 (ZO-1)] were evaluated in adrenal medulla. After 7 days, increased TH, DβH, PNMT, NPY, VMAT2 and SNAP25 mRNA levels were observed in mouse adrenal medulla, whereas ZO-1 mRNA levels decreased compared to controls. In contrast, after 21 days, UCS had induced a reduction of PNMT, NET, VMAT1, synthaxin1A, SNAP-25, VAMP2 and ZO-1 mRNA levels, but an increase of Cx43 mRNA levels, in the adrenal medulla. In addition, 21 days of UCS induced a decrease in protein levels of TH, DβH and PNMT. Lower epinephrine (EP) and norepinephrine (NE) content per protein in adrenal medulla and lower levels of EP in serum were also observed in mice submitted to 21 days of UCS. Regarding these results, this work suggests that, although there is an initial increase in the expression of catecholaminergic markers in the adrenal medulla, there is an impairment of adrenal medulla function in mice submitted to 21 days of stress exposures. The presence of chromaffin progenitor cells with proliferative potential was recently demonstrated in bovine adult adrenal medulla, but the physiological function of these cells remains to be elucidated. Therefore, to unravel whether chromaffin progenitor cells could play a role in adaptative responses to stressors, such like those observed in the previously referred mouse model of depression, the size of adrenal gland and the expression of chromaffin progenitor cell markers (Sox9, Notch1, Sox10, nestin, Mash1, Phox2b) in adrenal medulla were determined in mice submitted to UCS. It was observed that UCS induces an increase in adrenal gland weight and volume. Both adrenal cortex and medulla volume increased, but no alterations were observed in adrenal cortex/medulla volume ratio. After 7 days of UCS, adrenal medulla had lower mRNA levels of Sox9 and Notch1, whereas the mRNA levels of Mash1 and Phox2b were increased compared to controls. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), a maker of cell proliferation, was also decreased in adrenal medulla of mice after 7 days of UCS. In contrast, after 21 days of UCS no differences were observed in Sox9, Notch1, Sox10, nestin, Mash1, Phox2b and PCNA mRNA levels. Thus, 7 days of unpredictable stressor exposure induced a downregulation of regulators required for the maintenance of chromaffin progenitor cells at an undifferentiated state (Sox9, Notch1 and PCNA), with concomitant upregulation of transcriptional factors required for chromaffin cell differentiation [Mash1 (Ascl1) and Phox2b]. This evidence suggests that chromaffin progenitor cell differentiation induced by stress might play a role in the enhancement of adrenal medulla function during the first exposures to unpredictable stressors. Chromaffin progenitor cells were previously isolated from bovine adult adrenal medulla as free-floating spheres, named chromospheres. These chromospheres might represent an interesting in vitro model to study the mechanisms behind adrenal medulla adaptation to stress. Nevertheless, it is unknown whether chromaffin progenitor cells could also be present and isolated from human adult adrenal medulla. Therefore, the last aim of this work was the isolation, characterization and differentiation of chromaffin progenitor cells from adult human adrenal glands. Human chromaffin progenitor cells were cultured in low-attachment conditions for 10–12 days as free-floating spheres in the presence of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and endothelial growth factor (EGF). These primary human chromosphere cultures were characterized by the expression of several progenitor markers, including nestin, CD133, Notch1, nerve growth factor receptor (NGFR), Snai2, Sox9, Sox10, Phox2b and Ascl1. In opposition, PNMT, a marker for differentiated chromaffin cells, significantly decreased after 12 days in culture. Moreover, when plated on poly-L-lysine/laminin-coated slides in the presence of FGF-2, human chromaffin progenitor cells were able to differentiate into two distinct neuron-like cell types, TH+/β-III-tubulin+ cells and TH-/β-III-tubulin+ cells, and into chromaffin cells (TH+/PNMT+). These last findings from this work demonstrate that chromaffin progenitor cells are present in the human adrenal medulla and can be isolated and differentiated in vitro. Chromospheres cultures might therefore be a used as an in vitro model to study adrenal medulla development and adaptative responses to stress. These cultures are also a potential new cell source for cell transplantation and regenerative medicine, especially in the treatment of neuroendocrine and neurodegenerative diseases. In summary, this work contributes to a better understanding of adrenal medulla dysfunctions induced by chronic stress and allowed the establishment of a new in vitro model to identify the mechanism involved in adrenal medulla adaptive responses do stressors.
A glândula supra-renal é o principal órgão periférico envolvido na resposta ao stresse e as catecolaminas, libertadas pela medula supra-renal, são os principais mediadores de várias alterações fisiológicas necessárias para manter a homeostasia. No entanto, quando o stresse é prolongado e/ou repetitivo ocorrerão respostas adaptativas, incluindo na medula da glândula supra-renal, que podem contribuir para o desenvolvimento de doenças, tais como a depressão e a doença cardiovascular. Com o objetivo de compreender a fisiopatologia das disfunções relacionadas com o stresse, e particularmente os mecanismos de ligação entre a depressão e as doenças cardiovasculares que podem estar subjacentes à elevada co-morbilidade destas duas doenças, foi estudado o sistema catecolaminérgico da medula da glândula supra-renal num modelo animal de depressão induzida por exposição crónica a situações de stresse de forma imprevisível. Para isso, murganhos foram submetidos a 7 e 21 dias de stresse crónico imprevisível (UCS) e o conteúdo dos grânulos cromafins [neuropeptídeo Y (NPY) e cromogranina A (CgA)], as enzimas de síntese de catecolaminas [hidroxilase da tirosine (TH), β hidroxilase da dopamine (DβH) e metiltransferase da feniletanolamina (PNMT)], os transportadores de catecolaminas [transportador da noradrenalina (NET), transportador vesicular de monoaminas 1 e 2 (VMAT1 and VMAT2)], a maquinaria de exocitose [proteína associada ao sinaptossoma 25 (SNAP25), Sintaxina1A, proteína 2 associada à membrana da vesicula (VAMP2) e sinaptofisina] e a comunicação entre as células através de junções comunicantes [conexina 36 (Cx36), conexina (Cx43) e zonula oclusiva 1 (ZO-1)] foram avaliadas na medula da glândula supra-renal. Após 7 dias, foi observado um aumento dos niveis de mRNA da TH, DβH, PNMT, NPY, VMAT2 e SNAP25 na medula da glândula supra-renal de murganho, enquanto os níveis de mRNA da ZO-1 diminuíram comparativamente aos controlos. Em oposição, após 21 dias, o UCS induziu uma redução dos níveis de mRNA da PNMT, NET, VMAT1, sintaxina1A, SNAP-25, VAMP2 e ZO-1, mas um aumento dos níveis de mRNA da Cx43 na medula da glândula supra-renal. Além disso, 21 dias de UCS induziram uma diminuição dos níveis de proteína das enzimas de síntese das catecholaminas TH, DβH e PNMT. Também foi observado um menor conteúdo de adrenalina (EP) e noradrenalina (NE) por proteína na medula da glândula supra-renal e menores níveis de EP no soro dos murganhos submetidos a 21 dias de UCS. Tendo em conta estes resultados, este trabalho sugere que, apesar de haver um aumento inicial da expressão de marcadores catecolaminérgicos na medula da glândula supra-renal, há um prejuízo da função da medula da supra-renal em murganhos submetidos a 21 dias de UCS. A presença de células progenitoras cromafins com potencial proliferativo foi demonstrada na medula da supra-renal de bovinos, porém, a função fisiológica destas células continua por elucidar. Assim, de modo a perceber se as células progenitoras cromafins podem ter um papel nas respostas adaptativas induzidas pelo stresse, tais como as observadas no modelo animal de depressão descrito anteriormente, determinou-se o tamanho da glândula supra-renal e a expressão de marcadores de células progenitoras cromafins (Sox9, Notch1, Sox10, nestin, Mash1, Phox2b) na medula da glândula supra-renal de murganhos submetidos a UCS. Os resultados mostram que o UCS induz um aumento no peso e no volume da glândula-supra renal. Tanto o volume do córtex como da medula da supra-renal estavam aumentados, mas não foram observadas alterações da razão entre o volume do córtex e o volume da medula. Após 7 dias de UCS, a medula tinha níveis menores de mRNA da Sox9 e Notch1, enquanto os níveis de mRNA de Mash1 e Phox2b estavam aumentados comparativamente aos controlos. A expressão de antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), um marcador de proliferação celular, também estava diminuída na medula da glândula supra-renal de murganhos após 7 dias de UCS. Em oposição, após 21 dias de UCS não foram observadas diferenças nos níveis de mRNA da Sox9, Notch1, Sox10, nestina, Mash1, Phox2b e PCNA. Portanto, após 7 dias de exposição a condições de stress imprevisíveis ocorre uma diminuição dos reguladores necessários para a manutenção das células progenitoras cromafins num estado indiferenciado (Sox9, Notch1 and PCNA), com concomitante aumento de fatores de transcrição requeridos para a diferenciação das células cromafins. Estas evidências sugerem que a diferenciação das células progenitoras cromafins induzida pelo stresse pode ter um papel na melhoria da função da supra-renal durante as primeiras exposições a estímulos de stresse imprevisíveis. Células progenitoras cromafins foram já isoladas da medula da glândula supra-renal de bovinos sobre a forma de esferas em suspensão, denominadas “cromosferas”. Estas cromosferas podem representar um interessante modelo in vitro para estudar os mecanismos subjacentes à adaptação da medula da glândula supra-renal ao stresse. O último objetivo deste trabalho foi o isolamento, a caracterização e a diferenciação das células progenitoras cromafins obtidas de glândulas supra-renais adultas humanas. As células progenitoras cromafins humanas foram mantidas em cultura sobre a forma de esferas em suspensão, durante 10-12 dias, em condições de baixa aderência e na presença de fator de crescimento do fibroblasto-2 (FGF-2) e fator de crescimento do entotélio (EGF). Estas culturas primárias de cromosferas humanas foram caracterizadas pela expressão de vários marcadores de células progenitoras, incluindo nestina, CD133, Notch1, receptor do fator de crescimento neural (NGFR), Snai2, Sox9, Sox10, Phox2b, and Ascl1. Em oposição, o marcador de células cromafins diferenciadas, PNMT, diminuiu significativamente após os 12 dias de cultura das células. Além disso, as células progenitoras cromafins humanas quando colocadas em lamelas revestidas com poli-L-lisina/laminina e na presença de FGF-2 diferenciaram-se em dois tipos de células “neuron-like”, as células TH+/β-III-tubulinas+ e as TH-/β-III-tubulinas+, e em células cromafins (TH+/PNMT+). Estes resultados demonstram que as células progenitoras cromafins estão presentes na medula da glândula supra-renal humana e podem ser isoladas e diferenciadas in vitro. As culturas de cromosferas humanas podem assim ser utilizadas como modelo in vitro para o estudo do desenvolvimento da medula da glândula supra-renal e das suas respostas adaptativas ao stresse. Além disso, constituem uma potencial nova fonte de células para uso em transplantes celulares e medicina regenerativa, especialmente no tratamento de doenças neuroendócrinas e neurodegenerativas. Em sumário, este trabalho contribui para melhor compreender as disfunções da medula da supra-renal induzidas pelo stresse crónico e permite o estabelecimento de um novo modelo in vitro para identificar os mecanismos envolvidos nas respostas adaptativas da medula da supra-renal ao stress.
Descrição: Tese de doutoramento em Farmácia, na especialidade de Farmacologia e Farmacoterapia, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/23791
Direitos: openAccess
Aparece nas coleções:FFUC- Teses de Doutoramento

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato
Thesis_Magda Santana.pdf2.15 MBAdobe PDFVer/Abrir
Mostrar registo em formato completo

Visualizações de página 50

520
Visto em 26/mar/2024

Downloads

23
Visto em 26/mar/2024

Google ScholarTM

Verificar


Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.