Estudo da contribuição das integrinas na motilidade de células de glioblastoma

Abstract

Background: Glioblastoma (GBM) represente 50% of the tumors that arise within the central nervous system. The main features of GBM are the high proliferative andangiogenic potential, and the capacity of locally invasion. Despite the considerable advances in the knowledge of the mechanisms underlying the genetics, biology and clinical behaviour, GBM pathogenesis is not completely understood and until now, there is not a therapeutic strategy to reduce the invasive and proliferative ability of the glioma cells. The main objectives of this work were to evaluate: 1) the integrins expression in the human glioma cell line U-118; 2) the integrins contribution to GBM motility, proliferation and survival using an integrin αv and β3 subunits block, Shikonin; 3) the evaluation of the possible synergistic effect between Shikonin and Temozolomide (TMZ), the gold standard in GBM treatment. Methods and Results: In the human glioma cell line U-118, integrin expression was evaluated by western blot using specific antibodies. Then, taking account the integrin subunit more expressed in U-118 glioma cells, we evaluated the sensibility of cells to Shikonin and the effect on the expression of the integrin αv and β3 subunits. To elucidate the Shikonin effect on cell proliferation and death we used the BrdU/propidium iodide and annexin V assays, respectively, by Flow cytometry. The migration capabilities of U-118 glioma cells were studied by scratch assay. Moreover, to accomplished the results of apoptosis and migration, we observed the nuclear staining by Hoechst 33344 and stained the cells with falloidin to observed the f- actin organization by fluorescence and confocal microscopy, respectively. Regarding the integrin expression, our results showed that U-118 glioma cells expressed mainly the alpha V, beta 3 and alpha 5 subunits. So, we used an integrin blocker, the Shikonin, which induced a cytotoxic effect and also a reduction on αV and β3 integrin expression in U-118 glioma cells treated with this compound. Therefore, we evaluated the effect of Shikonin in growth and survival properties of U-118 glioma cells. The results showed a significant reduction in the migration and proliferation ability of GBM cells incubated with Shikonin and an activation of apoptosis, which was accompanied by a reduction in integrin expression. The simultaneous incubation of cells with Shikonin and Temozolomide induced a synergistic effect between these two drugs which suggests the possibility of Shikonin being used in glioma treatment. Conclusions: In this work, we demonstrated that the integrins subunits, more specific αV and β3 have a critical role in invasion, migration and proliferation in the glioma cells. The Shikonin appears to have a stronger modulatory effect in these glioblastoma cells properties. The blockage of integrins expression results in morphological and behavior alteration during the tumor progression. The Shikonin partly blocked the integrin subunits expression in glioma cells. Furthermore, the Shikonin induces apoptosis and decreases proliferation on glioma cells. The synergistic effect obtained between Shikonin and Temozolomide, suggests that combination of compounds with capability to block integrin αV and β3 subunits with conventional therapeutic approaches may represent a future strategy to inhibit tumor growth and the invasion into the tissues that surrounding tumor.

Introdução: O glioblastoma multiforme (GBM) constitui 50% dos tumores que invade o sistema nervoso central. As principiais caracteristicas do GBM são a elevada proliferação, angiogénese e a invasão local. Apesar dos avanços consideravéis relativamente aos mecanismos envolvidos na genética, biologia e no comportamento clínico, a patologia do tumor não está completamente compreendida. No entanto, até agora, não há uma estratégia terapêutica proporcione uma diminuição da invasão e proliferação tumoral nas células de GBM. Os principais objectivos deste trabalho foram avaliar: 1) a contribuição das integrinas numa linha celular de glioma humano, U-118, 2) a contribuição das integrinas na motilidade, proliferação e sobrevivência do GBM recorrendo a um bloqueador da expressão das subunidades das integrinas, Shikonin; 3) a existência de um efeito sinergístico entre a Shikonin e a temozolamida (TMZ), considerada o “gold standard” no tratamento do GBM. Métodos e Resultados: A expressão das integrinas foi avaliada através de western blot recorrendo a anticorpos específicos para as diferentes subunidade das integrinas. Tendo em conta as subunidades de integrinas mais expressas nas células de glioma U-118 , avaliou-se a sensibilidade que estas células possuem quando incubadas com o bloqueador da expressão das subunidades αV e β3, shikonin. Para além disso, determinou-se o efeito do mesmo na proliferação e apoptose das células através da quantificação do BrdU, iodeto de propidío e anexina V, respectivamente através de citometria de fluxo. Para observar a migração celular usou-se a técnica do Scracth nas celúlas U-118. Além disso, para complementar os resultados obtidos da apoptose e migração, observou-se a coloração nuclear com Hoechst 33344 e a faloidina para observar os filamentos de actina através de microscopia de fluorescência e confocal, respectivamente. A proliferação celular e apoptose foram determinadas através de um kit de BrdU/iodeto de propídeo. Para a identificação de apoptose inicial recorremos à marcação com anexina V. Relativamente à expressão das integrinas os nossos resultados demonstraram que a linha celular U-118 expressa maioritariamente as subunidades alfa V, beta 3 e alfa 5. Tendo em consideração este resultado, usou-se a Shikonin, um bloqueador da expressão das subunidades αV e β3, e verificou-se que possui um efeito citotóxico nas células U-118 e que ocorre uma diminuição da expressão das subunidades das integrinas, αV e β3. Portanto, avaliamos o efeito que a shikonin possui no crescimento e sobrevivência das células U-118. Os resultados demonstraram que a redução da expressão das integrinas é acompanhada pela redução das capacidades proliferativas e migratórias das células U-118, quando incubadas com a Shikonin e consequentemente induz a apoptose celular. Nas células U-118 sujeitas à incubação simultânea de shikonin com temozolomida, observou-se um efeito sinergístico entre os dois fármacos, sugerindo a possibilidade de usar a shikonin como agente quimioterapêutico em combinação com a temozolomida no tratamento do glioma. Conclusões: Neste trabalho, demostramos que as subunidades das integrinas, especificamente as subunidades αV e β3 possuem um papel importante na invasão, migração e proliferação das células de glioma. A shikonin aparenta ter um grande efeito modulador nas células de glioblastoma. O bloqueio da expressão das integrinas resulta numa alteração morfológica e comportamental durante a progressão tumoral. A shikonin bloqueia parcialmente a expressão das integrinas nas células do glioma. Para além disso, a shikonin induz apoptose e diminui a proliferação das células U-118. Os resultados obtidos do efeito sinergístico entre a shikonin e a temozolomida sugerem que a combinação de bloqueadores das subunidades das integrinas αV e β3 com a terapêutica convencional, poderá constituir uma estratégia futura para a inibição do crescimento e invasão tumoral para os tecidos que rodeiam o tumor.