Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10316/18178
Title: | Proliferative mechanisms controlled by nitric oxide in neural stem cells | Other Titles: | = Regulação dos mecanismos de proliferação de células estaminais neurais pelo óxido nítrico | Authors: | Carreira, Bruno Pereira | Orientador: | Carvalho, Caetana | Keywords: | Células estaminais; Óxido nítrico | Issue Date: | 18-Jan-2012 | Abstract: | Neural stem cells proliferate in the adult central nervous system (CNS)
in two main regions, the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) of
the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles.
The finding that neural stem cells are able to divide, migrate and differentiate
into several cellular types raised a new hope for restorative neurology. Nitric
oxide (NO), a pleiotropic signaling molecule in the CNS has been described to
be able to modulate the proliferation of neural stem cells, but whether it acts
as a pro- or anti-proliferative agent is still controversial. Some evidence
suggests that NO is a physiological inhibitor of cell proliferation. However,
under certain conditions, NO can act as a proliferative agent, favoring cell
proliferation. Thus, targeting the NO system may be a powerful strategy to
control cell proliferation/differentiation. However, the exact mechanisms by
which NO regulates neuronal proliferation and differentiation are not yet
clarified, and further investigation on this matter is needed.
Therefore, the main goal of this work was to study the mechanisms
that are involved in the dual effect of NO in neural stem cell proliferation.
Cultures of neural stem cells isolated from the SVZ of mice were exposed to a
NO donor, in a range of concentrations comprehending both physiological and
pathophysiological concentrations. We found that depending on the
concentration, NO can have opposite effects on the proliferation of neural
stem cells. Relatively low levels of NO, but already considered in the
pathopysiological range, increased the proliferation of neural stem cells, while
much higher levels of NO reduced proliferation. Very likely, different
mechanisms are responsible for this dual effect of NO on neural stem cell
proliferation.
The proliferative effect of NO in neural stem cells was further
investigated, and the underlying mechanisms involved were shown to be
dependent on the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK)
ERK1/2 pathway. We observed that NO rapidly bypasses the epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) and directly activates p21Ras, as early
as 2 min after exposure to NOC-18, triggering cell proliferation via activation of
the ERK/MAPK pathway. Moreover, the activation of the ERK/MAPK pathway
was shown to be involved in the activation of transcription factors, particularly
c-myc, p90RSK and Elk-1. Indeed, activation of p90RSK resulted in a
decrease in the nuclear presence of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1,
p27KIP1, which allows for cell cycle progression.
On the other hand, since the main intracellular receptor for NO is
guanylyl cyclase, we investigated whether the proliferative effect of NO was
mediated by cyclic GMP. We found that short-term exposure of neural stem
cell cultures to NO (6 h) increased cell proliferation in a cGMP-independent
manner by activating the ERK/MAPK signaling pathway, while long-term
exposure to NO (24 h) activated independently the two signaling pathways,
MAPK/ERK and the soluble guanylyl cyclase/cyclic GMP/protein kinase G.
Concerning the antiproliferative effect of NO, we found that the release
of high concentrations of NO by NOC-18 caused the nitration of the EGF
receptor, with intermediate formation of peroxynitrite, in SVZ-derived neural
stem cells expressing EGFR. Concomitantly with increased nitration in
tyrosine residues, NO caused a decrease in the phosphorylation status of the
EGFR. Moreover, using a culture model of SVZ-derived stem cells mixed with
microglia isolated from wild-type mice (iNOS+/+), similar results were obtained.
Thus the increased release of NO by activated iNOS+/+ microglial cells,
following treatment with LPS plus IFN-γ, caused nitration of EGFR, an
irreversible post-translational modification of tyrosine residues, which parallels
the decrease in proliferation of SVZ-derived neural stem cells treated with the
inflammatory stimulation. In addition, cells expressing EGF receptor showed a
strong labeling for 3-nitrotyrosine, indicative of protein nitration, following
treatment with NOC-18. MnTBAP, a scavenger of superoxide, was able to
prevent the nitration of the EGFR, as well as increased its phosphorylation
status. Furthermore, either MnTBAP, or FeTMPyP, which promotes the degradation of peroxynitrite, were able to rescue the proliferation of neural
stem cells in iNOS+/+mixed cultures following inflammation.
Finally, using an in vivo model of injury-induced neuroinflammation and
neurogenesis, the kainic acid model of temporal lobe epilepsy, we showed
that cell proliferation is prevented when the production of NO is abolished by
deleting the iNOS gene, in iNOS-/- mice, which strongly suggests that NO
promotes neural stem cell proliferation under certain pathophysiological
conditions in vivo.
Overall, the results presented in this work clarify the mechanisms by
which NO regulates the proliferation of neural stem cells. Thus, we show for
the first time that supraphysiological levels of NO have a dual effect on neural
stem cell proliferation, with different signaling mechanisms. Thus, the
p21/ERK/MAPK signaling pathway appears to be involved in the rapid effect of
NO in promoting cell cycle progression and early cell proliferation. For a longer
exposure to NO, two independent pathways appear to be active: the
p21/ERK/MAPK, and also the guanylyl cyclase/cGMP/PKG. Much higher
levels of NO administered to SVZ-derived stem cell cultures or in SVZmicroglia
mixed cultures, have an antiproliferative effect by decreasing the
signaling through the EGFR due to nitration of tyrosine residues in this
receptor.
Based on our work in the animal model and in cell cultures, our data
suggests that NO from inflammatory origin is mostly proliferative. This study
suggests that the modulation of the nitrergic system may be useful to harness
the potential of endogenous neural stem cells for brain repair. A proliferação de células estaminais neurais é um processo que ocorre no sistema nervoso central (CNS) adulto em duas regiões em particular: na zona subgranular (SGZ) do girus dentado (DG) do hipocampo e na zona subventricular (SVZ) que delimita os ventrículos cerebrais laterais. A descoberta de algumas propriedades das células estaminais neurais, como a capacidade proliferativa e de diferenciação em vários tipos celulares, trouxeram novas perspectivas para a terapia neuro-restaurativa. Portanto, o conhecimento dos mecanismos de regulação destas células constitui um foco de interesse da comunidade científica. O monóxido de azoto, também designado de óxido nítrico (NO), é uma molécula gasosa que intervém na sinalização de ínumeros processos biológicos. Em particular no CNS, o NO tem sido descrito como capaz de modular a proliferação de células estaminais neurais, mas se actua como um agente pró- ou anti-mitótico ainda é controverso, sendo cada vez mais aceite que possa actuar em ambos os sentidos. Alguns autores sugerem que o NO é um inibidor fisiológico da proliferação celular. No entanto, em certas condições, o NO pode actuar como um agente pró-mitótico, favorecendo a proliferação celular. Assim, a modulação do sistema nitrérgico poderá ser uma estratégia poderosa de controlo da proliferação/diferenciação celular. De facto, os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação e diferenciação neuronal ainda não estão esclarecidos, e uma investigação mais aprofundada sobre este assunto é necessária. Neste estudo, o objectivo principal foi estudar os mecanismos de regulação da proliferação das células estaminais neuronais pelo NO. Procurou-se entender qual o efeito do NO na proliferação destas células, se proliferativo ou antiproliferativo, e decifrar os mecanismos responsáveis por esses efeitos. Para a execução do trabalho foram conduzidas experiências in vitro e in vivo. Nas experiências in vitro, culturas de células estaminais neurais isoladas da SVZ de murganhos foram expostas a diferentes concentrações de um fármaco dador de NO, o NOC-18. Foram utilizadas concentrações de NOC-18 que permitiram uma libertação de NO compreendida entre valores fisiológicos e fisiopatológicas, como confirmado pela medição dos níveis de NO nos meios de cultura pela reacção de Griess. Dependendo da concentração, o NO pode ter efeitos opostos na proliferação das células estaminais neurais. Observámos que níveis relativamente baixos de NO, embora na gama fisiopatológica, aumentam a proliferação de células estaminais neurais em cultura, enquanto níveis mais elevados de NO induzem uma redução da proliferação celular. Muito provavelmente, diferentes mecanismos são responsáveis por este duplo efeito do NO na proliferação de células estaminais neurais. Estudámos em seguida os mecanismos envolvidos no efeito proliferativo do NO e observámos que o aumento de proliferação induzido pelo NO é dependente da activação da via de sinalização das proteínacinases activadas por mitogénios (MAPK). O NO entra na célula activando directamente a p21Ras, ultrapassando o receptor do EGF (EGFR). De facto, o NO activa a p21Ras após 2 minutos de incubação, sinalizando pela via das ERK/MAPK, envolvida na activação de factores de transcrição, como o Myc, Elk-1 e p90RSK, que regulam a progressão do ciclo celular. De facto, observámos que a activação da p90RSK resulta numa diminuição dos níveis nucleares da cinase dependente de ciclina 1, p27KIP1, permitindo a progressão do ciclo celular e consequentemente a mitose. Sendo a via de sinalização da guanilato ciclase um dos principais alvos intracelulares do NO, estudámos também o hipotético envolvimento desta via de sinalização na mediação do efeito proliferativo do NO. Curiosamente, a exposição de curta duração (6 horas) ao NO aumenta a proliferação celular de uma forma independente de cGMP, activando a via das p21/ERK/MAPK. Por outro lado, a exposição de longa duração (24 horas) ao NO parece activar ambas as vias de sinalização: a das p21/ERK/MAPK. Globalmente, os resultados apresentados neste trabalho esclarecem os mecanismos pelos quais o NO regula a proliferação de células estaminais neurais. Assim, mostramos que o NO, quando em níveis supra-fisiológicos, poderá ter um efeito duplo na proliferação celular, mediante a activação de diferentes mecanismos de sinalização. Deste modo, a via das p21/ERK/MAPK parece estar envolvida num efeito rápido do NO no sentido de promover a progressão do ciclo celular. Para uma exposição mais longa ao NO, duas vias independentes parecem estar activas: a via das p21/ERK/MAPK, que é a primeira a ser activada, e a via da guanilato ciclasecGMP- PKG. Para níveis muito mais elevados o NO tem um efeito antiproliferativo diminuindo a sinalização do EGFR por intermédio de um mecanismo de modificação proteica pós-translacional, a nitração. De acordo com resultados obtidos no modelo animal e de culturas mistas, o NO de origem inflamatória tem um efeito predominantemente proliferativo. Estes estudo sugere portanto que a modulação do sistema nitrérgico poderá ser útil para aproveitar o potencial das células estaminais neurais endógenas na terapia neuro-regenerativa. |
Description: | Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/18178 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
Tese_BC.pdf | 9.86 MB | Adobe PDF | View/Open |
Google ScholarTM
Check
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.