Profiling mycobacteria isolated from the houses of patients with NTM disease

Abstract

As micobactérias não tuberculosas (MNT) são microrganismos ubíquos e naturalmente resistentes a antibióticos e desinfetantes. Têm a capacidade de infetar seres humanos e colonizar ambientes antropogénicos, incluindo sistemas de abastecimento de água potável, o que representa uma possível ameaça para a saúde. Mycobacterium abscessus é uma espécie de crescimento rápido responsável por doenças pulmonares e infeções de tecidos moles. Diversos estudos relatam o isolamento desta espécie de águas potáveis e águas de ambientes domésticos a nível mundial. Embora seja a segunda MNT mais comum a causar infeção em Portugal, a informação sobre a colonização, prevalência e perfis de resistência antimicrobiana no país é limitada. Este estudo teve como objetivo isolar e identificar MNT presentes em amostras de água e biofilmes recolhidas do ambiente doméstico de doentes infetados com estas bactérias, residentes nas regiões centro e norte de Portugal. As MNT foram inicialmente identificadas com base na sequenciação do gene 16S rRNA. Todas as amostras de água/biofilmes revelaram ser positivas quanto à presença de MNT. No total foram identificados 244 isolados de MNT, pertencentes a 19 espécies diferentes. As espécies mais isoladas foram Mycobacterium chelonae/M. abscessus e Mycobacterium phocaicum/M. mucogenicum. Os isolados do complexo M. chelonae-abscessus (MCAC) foram submetidos a análise por RAPD, e os representantes de cada perfil foram selecionados para sequenciação de genoma. Foram realizados testes de suscetibilidade a antibióticos para determinar as concentrações mínimas inibitórias (CMI) em cinco isolados pertencentes ao MCAC. Os perfis de suscetibilidade foram obtidos pelo método de diluição em meio líquido contra 4 antibióticos selecionados por serem os mais utilizados no tratamento dos doentes infetados com MNT. Entre os antibióticos testados, a amicacina e a claritromicina (CLA) demonstraram ser os mais eficientes, uma vez que a maioria dos isolados era suscetível. Todos os isolados demostraram ser resistentes a imipenem. M. abscessus apresentou resistência adquirida à claritromicina. O perfil com maior resistência foi observado em M. chelonae subsp. bovis, que revelou resistência intermédia ou resistente a todos os antibióticos testados. A análise do genoma para genes de resistência antimicrobiana (erm (41) e erm (55)) foi realizada em M. abscessus e M. chelonae subsp. bovis. M. abscessus possui o gene erm (41) T28 de tipo selvagem, que é responsável por conferir resistência induzível a CLA. M. chelonae subsp. bovis não possuía nem o gene erm (41), nem o gene erm (55).Muitas das MNT isoladas têm potencial para ser patógenos oportunistas para humanos, revelando a importância deste estudo. Este estudo fornece informações para potenciais associações entre as espécies de MNT encontradas na água potável e as isoladas de pacientes. Este trabalho fornece informações valiosas sobre uma área pouco explorada no país, tornando-o um estudo pioneiro para a exploração de NTM na água doméstica e estabelecendo as bases para estudos adicionais explorarem um espectro mais amplo de variáveis e dinâmicas.

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are ubiquitous microorganisms naturally resistant to common antibiotics and disinfectants. They have the ability to infect humans and colonize man-made environments, including drinking water supply systems, which pose a potentially serious health threat. Mycobacterium abscessus is a rapidly growing species responsible for pulmonary disease and soft tissue infections. Studies worldwide have isolated this species from household and drinking waters. Although it is the second most common NTM to cause infection in Portugal, information regarding the colonization, prevalence and associated antimicrobial resistance profiles in the country is limited. This study aimed to isolate and identify NTM present in water and biofilm samples collected from the domestic environment of patients infected with these bacteria, living in the center and north regions of Portugal. NTM were initially identified based on 16S rRNA gene sequencing and all water/biofilm samples were positive for NTM. In total, 244 NTM isolates were identified, belonging to 19 different species. The most frequently isolated species were Mycobacterium chelonae/abscessus and Mycobacterium phocaicum/mucogenicum. Those revealed to be members of the M. chelonae-abscessus complex (MCAC) were submitted to RAPD analysis and representatives of each profile were selected for whole genome sequencing. Antibiotic susceptibility testing was also performed to determine the minimal inhibitory concentrations (MIC) of five MCAC isolates. Susceptibility profiles were obtained by broth dilution method against 4 antibiotics, which were selected as they are used in patient’s treatment. Among the tested antibiotics, amikacin and clarithromycin (CLA) demonstrated to be the most efficient, since the majority of isolates were susceptible. All isolates were resistant to imipenem. Acquired resistance to clarithromycin was present in the M. abscessus strain. M. chelonae subs. bovis exhibited the highest resistance profile, as it was intermediate or resistant to all tested antibiotics. Genome sequence analysis for antimicrobial resistance genes (erm (41) and erm (55)) was performed for M. abscessus and M. chelonae subsp. bovis isolates. M. abscessus harbored the wild-type erm (41) T28 gene, which is responsible for conferring inducible CLA resistance. The M. chelonae subsp. bovis isolate lacked both erm (41) and erm (55) genes.Several NTM isolated have the potential to be opportunistic pathogens to humans, underscoring the significance of this study. These findings provide insights for potential associations between NTM species found in drinking water and the clinical isolates from patients. The present work provides valuable insights into a barely explored area in the country, marking it a pioneer study for the investigation of NTM prevalence in household water and laying the groundwork for future studies aiming at broader spectrum of variables and dynamics.