Hit-to-lead optimization of novel RIPK1 inhibitors with anti-necroptotic activity

Abstract

A morte celular é um mecanismo evolutivo que tem um papel crítico no desenvolvimento, na homeostase e na progressão de diversas doenças em organismos. A primeira classificação de morte celular baseava-se em aspetos morfológicos e estruturais, tendo dividido a morte celular em três tipos: apoptose (tipo I), morte celular dependente de autofagia (tipo II) e necrose (tipo III).Ao longo das últimas quatro décadas, a descoberta e caracterização de proteínas e vias de sinalização associadas a diferentes tipos de morte celular, revelaram que a classificação inicial era insuficiente para retratar a complexidade dos diferentes tipos de morte celular existentes. O que culminou com a criação dos atuais doze tipos de morte celular regulada (RCD).A necroptose é um tipo de RCD que apresenta as características morfológicas clássicas da necrose. Na maioria das vias de sinalização da necroptose, as proteínas serina/treonina cinase de interação com receptores 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) são ativadas, levando à fosforilação da pseudocinase com domínio cinase semelhante à de linhagem mista (MLKL). Uma vez ativa, a MLKL vai causar a rutura da membrana e a libertação do conteúdo celular. Esta libertação para o meio extracelular gera respostas inflamatórias e contribui para a geração de doenças inflamatórias crónicas.Devido ao papel da necroptose em diversas doenças, é esperado com sua regulação tenha um elevado impacto terapêutico. A inibição da necroptose pode ser aplicada como tratamento num largo espectro de doenças, cuja base é a inflamação associada à morte de um certo tipo de células.Um estudo em modelos celulares foi utilizado para selecionar compostos com atividade anti-necroptótitca. Neste foram identificados dois novos compostos com uma potência elevada contra a RIPK1 e com estruturas diferentes das presentes em inibidores conhecidos.Neste trabalho, a estrutura de cada um destes compostos foi explorada em campanhas de otimização. Antes de iniciar o processo de otimização, a novidade estrutural dos compostos foi analisada através de uma comparação com estruturas de inibidores da RIPK1 conhecidos. Ambos os compostos apresentaram vantagens estruturais comparativamente aos inibidores conhecidos.A partir da estrutura central de um dos compostos foi desenvolvida a família dos benzimidazóis, onde todos os compostos foram constituídos por um grupo benzimidazol substituído na posição 2 por um anel heterocíclico de 5 membros. O grupo de 25 novos compostos desta família, gerados por uma metodologia de síntese convergente, foi testado em ensaios enzimáticos com a RIPK1 e em ensaios celulares de inibição da necroptose. O composto que apresentou a maior efeito protetor nas avaliações biológicas foi selecionado para estudos adicionais. A sua atividade inibitória para a RIPK1, durante a necroptose em células, foi confirmada com estudos de immunoblot. Adicionalmente, o modo de inibição deste composto foi estudado através de estudos de competição com ATP, onde foi caracterizado como inibidor competitivo. Por fim, num estudo de seletividade contra um grupo de cinases foi observada uma elevada seletividade para a RIPK1.Foi também desenvolvida uma família de benzoxazepinas com base na estrutura do segundo novo composto identificado. Nesta todos os compostos partilhavam uma estrutura central com um anel 2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]oxazepina ligado por um grupo amida a um anel heterocíclico de 5 membros. Durante o desenvolvimento de alguns dos compostos desta família, foi observada uma duplicação de sinais nos espectros de RMN de 1H e 13C sugerindo a existência de isómeros de rotação. A presença de isómeros de rotação foi confirmada através de estudos de RMN de temperatura variável (VT). A existência de impedimento na rotação da ligação simples entre o anel heterocíclico de 5 membros e o grupo carbonilo da amida (Ar-CO) e na ligação amida (N-CO) foi estudada através da medição das cargas dos átomos do anel heterocíclico de 5 membros e de estudos de mecânica quântica.Os 17 novos compostos da família das benzoxazepinas foram analisados em estudos enzimáticos com a RIPK1 e em modelos celulares de inibição da necroptose. O composto que apresentou a maior efeito de proteção da necroptose nestes estudos foi selecionado para ensaios adicionais. Em estudos de immunoblot foi confirmada a sua atividade inibitória da RIPK1 durante o processo de necroptose. Por outro lado, estudos de competição com ATP permitiram a caracterização deste composto como inibidor competitivo.Adicionalmente, um projeto colaborativo resultou no estudo de dois compostos pertencentes à família das 7-fenilquinolinas. Ambos foram caracterizados como inibidores da RIPK1. O composto mais potente foi ainda classificado como inibidor competitivo da RIPK1.Este trabalho permitiu o desenvolvimento e estudo de três novas classes de inibidores da RIPK1, culminando com a identificação de promissores inibidores competitivos da necroptose com atividades na região do nanomolar.

Cell death is an evolutionarily conserved mechanism that plays a critical role in the development, homeostasis, and disease of an organism. The first classification of cell death was based on morphological and structural details and divided cell death modalities into three types: apoptosis (type I), autophagy-dependent cell death (type II), and necrosis (type III).Throughout the last four decades, key molecular players and signaling pathways of cell death were discovered and characterized, revealing that the early classification was largely insufficient to depict the complexity of the different cell death modalities. These findings culminated in the emergence of twelve subroutines of regulated cell death (RCD).Necroptosis is a type of RCD that displays the classic necrotic cell death morphological features. Most necroptosis pathways activate receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1) and 3 (RIPK3), causing the phosphorylation of mixed lineage kinase domain like pseudokinase (MLKL). The activation of MLKL leads to plasma membrane permeabilization and a subsequent release of cellular content. The release of cellular components into the extracellular microenvironment causes inflammatory responses and contributes to the pathogenesis of chronic inflammatory diseases.Necroptosis is present in an array of human diseases, and its regulation is expected to have a broad therapeutic impact. Necroptosis inhibition could be applied as a treatment for a wide range of human diseases, where inflammation would be restrained and the death of a certain type of cell at the core of the medical condition would be prevented.A necroptosis inhibition high-throughput cell-based screening was carried out to identify new compounds with antinecroptotic activity. Two novel hit compounds with high potency against RIPK1 and a dissimilar scaffold from the known necroptosis inhibitors were identified.In this work, the scaffold of each of these discovered hit compounds was explored in hit-to-lead optimization campaigns. Before starting the campaigns, the structural novelty of the discovered hit compounds was assessed by performing a comparison with literature RIPK1 inhibitor structures. Both compounds exhibited structural advantages compared to the known inhibitors.A benzimidazole series was developed based on one of the hit scaffolds. In this family, all final compounds exhibited a core structure formed by a benzimidazole moiety substituted in position 2 by a 5-membered heterocyclic ring. A group of 25 novel final benzimidazole series compounds were synthesised by a convergent synthetical approach and tested in enzymatic assays against RIPK1 as well as in necroptosis inhibition cell-based assays.The benzimidazole series compound that exhibited the best overall results in the biological assessment was selected for additional studies. Its RIPK1 inhibitory activity during necroptosis in a cell model was confirmed with immunoblot studies. Additionally, its mode of inhibition was studied in ATP competitive assays, where it was characterized as a competitive inhibitor. Finally, a kinase profiling experiment was carried out to study its selectivity, revealing a good selectivity for RIPK1.A benzoxazepine series was also developed , resulting in compounds with a structural core of a 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[f][1,4]oxazepine ring connected to a 5-membered heterocyclic ring by an amide moiety. Throughout the development of these compounds, a signal duplication phenomenon was observed in the 1H and 13C NMR spectra of several developed compounds suggesting the existence of rotational isomers. This type of conformational isomerism was confirmed by variable temperature (VT) NMR studies. The existence of hindered rotation at the single bond connecting the 5-membered heterocyclic ring to the amide carbonyl group (Ar-CO bond) and at the amide bond (N-CO bond) was assessed by studying the charges of the 5-membered heterocyclic ring atoms and performing quantum mechanics studies.The 17 novel final benzoxazepine series compounds were studied in enzymatic assays against RIPK1 and necroptosis inhibition cell-based assays. The benzoxazepine series compound that exhibited the best results in the biological assessment was selected for additional studies. Immunoblot studies with this compound confirmed its RIPK1 inhibitory activity during necroptosis in a cell model. Furthermore, ATP competitive assays allowed its characterization as a competitive inhibitor.Additionally, a collaborative project led to the development and study of two compounds belonging to a 7-phenylquinoline family. Both compounds were characterized as RIPK1 inhibitors. The compound with the highest potency was also classified as competitive inhibitor of RIPK1 on ATP competitive studies.This work allowed the development and study of three novel classes of RIPK1 inhibitors, culminating in the identification of promising competitive nanomolar necroptosis inhibitors.