Treating Glioblastoma: a novel therapeutic approach based on natural products

Abstract

Glioblastoma (GB), the most malignant and prevalent glioma of the central nervous system (CNS), is a grade IV adult-type diffuse glioma. Despite considerable efforts, it continues to have a dismal 5-year survival rate of around 6%. The challenges stem from the tumor's high heterogeneity, the absence of effective early diagnostic tools, poor prognosis, and limited treatment options. Currently, the standard of care involves maximum surgical resection followed by chemotherapy/radiotherapy and adjuvant chemotherapy with temozolomide (TMZ). Unfortunately, this treatment faces several hurdles, leading to disease relapse and reduced survival rates. Therefore, there is an urgent need to explore novel therapeutic strategies and identify new drug candidates. In this pursuit, the development of therapies based on plant-based compounds emerges as a promising avenue to enhance patient survival and well-being.Medicinal plants are rich sources of bioactive natural compounds with multiple therapeutic effects, making them potential sources of lead compounds for the discovery of new anticancer drugs. The screening, isolation, and identification of secondary metabolites from these plants have laid the foundation for potent derivatives used in chemotherapy. Diterpenes, a class of secondary metabolites found in plants, exhibit extensive therapeutic activities, including antitumor properties, making them promising natural drug leads for cancer. Exploring medicinal plants, such as Plectranthus species, which are rich in diterpenes, holds great promise for discovering new bioactive compounds to combat GB.7α-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone (Roy) and Parvifloron D (ParvD) are abietane diterpenes isolated from the acetonic extract from Plectranthus hadiensis Schweinf. (P. hadiensis) and Plectranthus ecklonii Benth. (P. ecklonii), respectively. Previous studies have shown their therapeutic effects against various cancer types.In this context and driven by the limitations of conventional treatments, the antitumor effect of these naturally occurring abietane diterpenes was investigated in this work, in a panel of 5 glioma cell lines to mimic the heterogeneity of GB, aiming to identify their antitumor mechanisms of action and to establish them as leading compounds for future therapeutic approaches against this tumor.In Chapter IV, we discovered that Roy induced cell cycle arrest at the G2/M phase and apoptosis by affecting the mitochondrial membrane potential (MMPotential), inhibiting the expression of anti-apoptotic proteins, and increasing activated caspase-3 expression. Roy also promoted upregulation of tumor suppressor genes (TP53, PTEN) and downregulation of oncogenes (BCL2, BCL2L1, MDM2) across all GB cells. Notably, the concentrations of Roy required to achieve significant inhibitory effects were much lower than those of TMZ, the standard first-line treatment. Interestingly, treatment with Roy also targeted autophagy-related pathways, a conserved cellular mechanism used by GB cells as a survival pro-tumoral response. In chapter V, we observed that Roy affected the expression of proteins associated with autophagy (Beclin-1, LC3, p62, and ATG5), inhibiting autophagy initiation and activating pro-apoptotic mechanisms. Roy’s ability to suppress autophagy as a pro-tumoral mechanism was supported by the downregulation of ULK1 and modulation of AMPK and mTOR-associated pathways. Regarding the antitumor effect of ParvD, in Chapter VI, we found that it induced cell cycle arrest at G2/M, disrupted MMPotential, and promoted apoptosis through the intrinsic mitochondria-dependent pathway. ParvD also increased activated caspase-3 and upregulated tumor suppressor genes while downregulating oncogenes in GB cells. Similar to Roy, ParvD also required substantially lower concentrations than TMZ to achieve pronounced inhibitory effects.Consequently, both Roy and ParvD exhibited strong antitumor activity against GB cells. In Chapter VII, this effect was further confirmed in a 3D cell model of GB, with Roy demonstrating a more pronounced impact. Notably, we observed that in the presence of conditioned medium derived from GB, microglia, and co-cultures of GB and microglia cells, Roy's efficacy was enhanced, while ParvD showed a reduction in its cytotoxic and antiproliferative effects. This aligns with Roy's compelling immunomodulatory influence on factors associated with neuroinflammation, a critical hallmark of GB.In light of these findings, although both abietane diterpenes hold promise as potential antitumor agents, Roy emerges as the more promising candidate. It targets multiple cellular processes associated with GB growth and invasiveness, making it a compelling avenue for exploration in future therapeutic strategies for this incurable and challenging tumor.

O glioblastoma (GB), o glioma mais maligno e prevalente do sistema nervoso central (SNC), é um glioma difuso do tipo adulto de grau IV. O GB apresenta uma taxa de sobrevivência a 5 anos muito baixa (~6%), devido à elevada heterogeneidade do tumor, à falta de métodos de diagnóstico, ao fraco prognóstico e às limitações do tratamento atual. Atualmente, o tratamento de primeira linha consiste na resseção cirúrgica seguida de quimioterapia/radioterapia e quimioterapia adjuvante utilizando temozolomida (TMZ). No entanto, este tratamento enfrenta vários desafios, levando a uma reincidência do tumor e a taxas de sobrevivência reduzidas. Desta forma, é necessária a procura de novas estratégias terapêuticas e identificação de novas moléculas bioativas. Neste desafio, o desenvolvimento de terapias baseadas em compostos de origem natural aparece como uma abordagem promissora.As plantas medicinais são fontes importantes de compostos bioativos com diversos efeitos terapêuticos, o que as torna potenciais fontes de compostos com potencial quimioterapêutico. A triagem, isolamento e identificação de metabolitos secundários de plantas medicinais serviu de base para o desenvolvimento de fármacos quimioterapêuticos. Os diterpenos exibem diversas atividades biológicas, incluindo propriedades antitumorais, o que os torna promissores para serem utilizados como drug lead para o tratamento do cancro. A investigação com plantas medicinais, como o género Plectranthus rico em diterpenos, apresenta uma elevada esperança para a descoberta de novos compostos bioativos para tratar o GB.O 7α-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone (Roy) e a parviflorona D (ParvD) são diterpenos abietanos isolados do extrato acetónico de Plectranthus hadiensis Schweinf. (P. hadiensis) e Plectranthus ecklonii Benth. (P. ecklonii), respetivamente. Estudos prévios demonstraram o seu potencial contra vários tipos de cancro. Neste contexto e seguindo as limitações do tratamento convencional, neste trabalho foi investigado o efeito antitumoral destes dois diterpenos abietanos num painel de 5 linhas celulares de glioma, de forma a mimetizar a heterogeneidade do GB, com o objetivo de identificar os seus mecanismos de ação antitumoral e estabelecer estes compostos como leading drugs para futuras abordagens terapêuticas contra este tumor.No Capítulo IV, identificámos a capacidade do Roy induzir paragem do ciclo celular na fase G2/M e apoptose, através da perda do potencial de membrana mitocondrial (MMPotential), inibição da expressão de proteínas antiapoptóticas e aumento dos níveis de caspase-3 ativada. Roy também promoveu uma regulação positiva de genes supressores de tumor (TP53, PTEN) e uma inibição dos níveis de mRNA de oncogenes (BCL2, BCL2L1, MDM2) nas linhas celulares de GB estudadas. É de salientar que as concentrações de Roy necessárias para induzir um efeito inibitório significativo na viabilidade celular são consideravelmente mais baixos comparativamente com as concentrações verificadas para a TMZ. Curiosamente, o tratamento com o Roy teve um efeito nas vias de sinalização associadas à autofagia, um mecanismo celular utilizado pelo GB como uma resposta pro-tumoral de sobrevivência. No Capítulo V, observámos que o Roy afetou a expressão de proteínas associadas à autofagia (Beclin-1, LC3, p62 e ATG5), inibindo a iniciação da autofagia e ativando mecanismos pro-apoptóticos. A capacidade do Roy em suprimir autofagia, foi suportado pela redução da expressão da ULK1 e modulação das vias de sinalização associadas à AMPK e mTOR.Relativamente ao efeito antitumoral da ParvD, no Capítulo VI, observou-se que esta induz paragem do ciclo celular na fase G2/M, reduz o MMPotential e promove apoptose através da via intrínseca dependente da mitocôndria. ParvD também aumentou os níveis de caspase-3 ativada e de mRNA de genes supressores de tumor, enquanto reduziu os níveis de mRNA de oncogenes em células de GB. À semelhança do Roy, ParvD também necessita de concentrações substancialmente mais baixas que a TMZ para induzir um efeito inibitório pronunciado.Consequentemente, Roy e ParvD exibiram atividade antitumoral em células de GB. No Capítulo VII, este efeito foi confirmado em modelos celulares 3D do GB, em que o Roy demonstrou uma melhor atividade. Curiosamente, observámos que na presença de meios condicionados obtidos de culturas e coculturas de células da microglia e de GB, a eficácia do Roy sofreu um aumento, enquanto a ParvD apresentou uma redução no seu potencial citotóxico. Isto está de acordo com o impacto imunomodulador do Roy em proteínas associadas com a neuroinflamação, uma característica importante do GB.Seguindo estas descobertas, apesar de ambos os diterpenos abietanos serem moléculas antitumorais promissoras, o Roy demarca-se como o candidato mais promissor. Este tem como alvo vários processos celulares associados com a proliferação e caráter invasivo do GB, o que o torna interessante para a procura de futuras estratégias terapêuticas para este tumor incurável.