Metabolic modeling of cancer stem cells and interplay between cancer metabolism and epigenetics

Abstract

O cancro é uma doença com elevada taxa de mortalidade cuja incidência tem aumentado nos últimos anos. As Células Cancerígenas Estaminais (CSCs) são conhecidas por contribuírem para a agressividade, metastização, resistência à quimio/radioterapia, e recorrência do cancro. Além disso, estudos recentes têm enfatizado a importância da reprogramação metabólica das CSCs para a manutenção e progressão do fenótipo cancerígeno através da satisfação de necessidades energéticas e o fornecimento de metabolitos fundamentais para o rápido crescimento celular. Consequentemente, é indispensável desenvolver estratégias terapêuticas específicas dirigidas ao metabolismo das CSCs. Entre os fatores que podem contribuir para o aparecimento e progressão do cancro está o desequilíbrio de mecanismos regulatórios epigenéticos como a metilação do DNA, que pode promover perfis de expressão génica aberrantes sem afetar a sequência do DNA. Esses mecanismos podem influenciar a transcrição de genes que codificam proteínas de sinalização e proteínas regulatórias, mas também enzimas. Logo, a perturbação de regulação epigenética pode induzir alterações metabólicas que contribuem para a aquisição de fenótipos cancerígenos. Do mesmo modo, visto que alguns metabolitos são substratos e cofatores de reguladores epigenéticos, a sua disponibilidade pode afetar mecanismos epigenéticos de tal forma que as alterações metabólicas podem contribuir para o aparecimento e a progressão do cancro através de desregulação epigenética. Dada a interação entre metabolismo, cancro e epigenética, investigação recente tem sido desenvolvida na fronteira entre esses processos biológicos numa tentativa de identificar novos mecanismos de doença e potenciais alvos terapêuticos. Modelos metabólicos à escala genómica (GSMMs) são representações matemáticas da rede composta por todas as reações metabólicas de uma célula e dos genes que codificam enzimas que catalisam essas reações, que podem ser usados para simular in silico o estado metabólico das células. GSMMs têm sido muito úteis na previsão de fenótipos metabólicos de diferentes organismos e tipos celulares, incluindo células cancerígenas. No entanto, GSMMs de CSCs ou de células cancerígenas diferenciadas (CCs) materializando a interação entre metabolismo e metilação de DNA, o qual é um mecanismo epigenético, não foram desenvolvidos até ao momento. No primeiro estudo apresentado nesta tese, GSMMs foram construídos para CSCs e CCs de dez diferentes tecidos, usando algoritmos de reconstrução. A melhor estratégia de reconstrução foi selecionada e implementada para obter os modelos. Os modelos foram “gapfilled” para ser possível simular crescimento e para que pudessem realizar “tasks” metabólicas, e de seguida foram validados através da comparação de genes essenciais simulados e genes letais identificados com experiências de “knockout” génico. Simulações de fluxo foram usadas para prever fenótipos metabólicos, identificar potenciais alvos terapêuticos e detetar factores de transcrição (TFs), miRNAs e antimetabolitos já conhecidos que possam ser usados como estratégia de reutilização de medicamentos contra o cancro. Além disso, os resultados estavam de acordo com a evidência experimental, forneceram uma perceção de novos mecanismos metabólicos para agentes já conhecidos, e permitiram a identificação de novos alvos potenciais e compostos que possam ser interessantes para posterior validação in vitro e in vivo. No segundo estudo desta tese, um GSMM genérico de uma célula humana, integrando reações de metilação e demetilação do DNA recolhidas da literatura e bases de dados foi primeiramente obtido, e depois, a melhor de diferentes estratégias de reconstrução foi identificada e aplicada ao modelo genérico para criar GSMMs de 31 linhas celulares de cancro humano. Modelos metabólicos à escala genómica melhorados com limitações enzimáticas usando dados cinéticos e ómicos (GECKOs) foram posteriormente construídos a partir de GSMMs para melhorar a precisão da simulação de fluxos sem a necessidadede pré-definir taxas de captação ou produção de qualquer metabolito. Além disso, níveis de metilação do DNA específicos para cada linha celular foram incluídos nos modelos sob a forma de coeficientes na reação de composição do DNA com o propósito de retratar a influência do metabolismo sobre a metilação global do DNA in diferentes linhas celulares de cancro. As simulações de fluxo demonstraram a capacidade destes modelos de simular fluxos de reações de troca similares às equivalentes taxas de captação ou secreção e de fazer boas previsões funcionais. Estes modelos poderão ser utilizados na identificação futura de novos potenciais alvos terapêuticos contra o cancro.

Cancer is a disease with a high mortality rate whose incidence has risen in the past years. Cancer Stem Cells (CSCs) are known to contribute to cancer aggressiveness, metastasis, chemo/radio-therapy resistance, and tumor recurrence. Furthermore, recent studies have emphasized the importance of metabolic reprogramming of CSCs for the maintenance and progression of the cancer phenotype through the fulfillment of the energetic requirements and the supply of substrates fundamental for fast-cell growth. Therefore, it is of paramount importance to develop therapeutic strategies tailored to target the metabolism of CSCs.Among the factors that can contribute to cancer onset and progression is the imbalance of epigenetic regulatory mechanisms like DNA methylation, which can promote aberrant gene expression profiles without affecting the DNA sequence. Those mechanisms can influence the transcription of genes encoding signaling and regulatory proteins, but also metabolic enzymes. Hence, the disruption of epigenetic regulation may induce metabolic shifts that contribute to the acquisition of cancerous phenotypes. Likewise, since some metabolites are substrates and cofactors of epigenetic regulators, their availability can impair epigenetic mechanisms, in such a way that metabolic shifts may feed cancer progression and onset through epigenetic deregulation. Given the interplay between metabolism, cancer, and epigenetics, recent research has been developed on the frontiers between those biological processes in an attempt to identify new disease mechanisms and potential therapeutic targets. Genome-Scale Metabolic Models (GSMMs) are mathematical representations of a network of all metabolic reactions in a cell and genes encoding enzymes catalyzing those reactions that can be used to simulate in silico the metabolic state of cells. GSMMs have been very useful in the past to predict metabolic phenotypes of different organisms and cell types, including cancer cells. Nevertheless, GSMMs of CSCs or of differentiated Cancer Cells (CCs) embodying the interaction between metabolism and DNA methylation, which is an epigenetic mechanism, have not been developed so far. In the first study presented in this thesis, computational GSMMs were built for CSCs and CCs of ten different tissues using reconstruction algorithms. The best reconstruction strategy was selected and implemented to obtain the models. Models were gapfilled to be able to simulate growth and perform metabolic tasks, and then, they were validated through the comparison of simulated essential genes and lethal genes identified from gene knockout experiments. Flux simulations were used to predict metabolic phenotypes, identify potential therapeutic targets, and spot already-known Transcription Factors (TFs), miRNAs, and antimetabolites that could be used as part of drug repurposing strategies against cancer. Furthermore, results were in accordance with experimental evidence, provided insights into new metabolic mechanisms for already known agents, and allowed for the identification of potential new targets and compounds that could be interesting for further in vitro and in vivo validation. In the second study of this thesis, a generic GSMM of a human cell integrating DNA methylation or demethylation reactions collected from literature and databases was first obtained, and then, the best of different reconstruction strategies was identified and applied to the generic model to create GSMMs for 31 human cancer cell lines. Genome Scale Metabolic Models enhanced with Enzymatic Constraints using Kinetic and Omics data (GECKOs) were subsequently built based on those GSMMs to improve the accuracy of the simulated reaction fluxes without the need to pre-define uptake or secretion rates for any metabolite. Furthermore, cell-line specific DNA methylation levels were included in the models in the shape of coefficients of DNA composition reaction in an effort to depict the influence of metabolism over global DNA methylation in different cancer cell lines. Flux simulations demonstrated the ability of these models to provide simulated fluxes of exchange reactions similar to the equivalent experimentally measured uptake/secretion rates and to make good functional predictions. These models might be useful in the future identification of potential new therapeutic targets against cancer.