Role of Src kinase family in Huntington’s disease - impact on neurites and mitochondria

Abstract

A Doença de Huntington (DH) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, sem terapias eficazes. A doença é causada pela extensão de repetições do trinucleótido citosina-adenina-guanina no exão 1 do gene da huntingtina (HTT). A expressão de HTT mutante, a principal alteração proteica na DH, influencia a formação de espécies reativas de oxigénio (ROS), os níveis de antioxidantes, altera as vias de degradação proteica, a atividade mitocondrial e a atividade e localização dos recetores NMDAR. Dois membros da família das proteínas Src cinase (SKF), c-Src e Fyn, são ativados por ROS, modulam vias envolvidas na defesa antioxidante, têm papéis importantes na função mitocondrial e regulam a atividade e localização dos NMDARs. No entanto, o envolvimento de c-Src/Fyn na DH não se encontra suficientemente explorado. No presente trabalho, investigamos o envolvimento das proteínas SKF na patogénese da DH em modelos humanos e de murganho, bem como o seu possível envolvimento em alterações redox, função mitocondrial e sinalização relacionada com a ativação dos NMDAR na DH.Estudos prévios, do nosso grupo de investigação, mostraram que células estriatais da DH apresentam um aumento do níveis de ROS e uma diminuição dos níveis proteicos de Nrf2, apesar de um aumento da sua fosforilação, sendo Nrf2 o principal fator de transcrição envolvido na expressão de enzimas de defesa celular. Assim, nesta tese mostramos um aumento da fosforilação de Nrf2 no resíduo de Ser40 e a fosforilação/ativação da SKF no resíduo de Tyr416 após exposição aguda de células neurais HT22 a peróxido de hidrogénio (H2O2). A ativação citosólica do Nrf2 é modulada através da fosforilação por PKC, uma enzima controlada pelas SKF. A fosforilação do Nrf2 no resíduo Ser40, assim como a sua migração para o núcleo e atividade transcricional envolvendo a expressão da heme oxigenase-1 são dependentes da ativação da SKF. Além disso, a modulação da atividade de Nrf2 pela c-Src ocorre através da fosforilação de PKC no resíduo de Tyr311. Demonstramos que a regulação da atividade transcricional de Nrf2, via ativação de PKC, é mediada pela SKF, após um estímulo agudo de H2O2. Estes resultados indicam um papel de SKF, nomeadamente da c-Src, no controlo da atividade transcricional de Nrf2 em condições de oxidação celular, comuns a diversas doenças neurodegenerativas, tais como a HD. Os estudos subsequentes foram conduzidos de forma a investigar o envolvimento da SKF na patogénese da HD. Assim, demonstramos claramente que os níveis das proteínas c-Src e Fyn se encontram reduzidos em diferentes modelos de DH, nomeadamente no núcleo caudado de cérebro humano postmortem, estriado e córtex cerebral do murganho YAC128 em estádios iniciais, neurónios estriatais YAC128 e linhas de células estriatais Q111. Os níveis diminuídos das proteína c-Src e Fyn resultam de um aumento da sua degradação por autofagia e são acompanhados por uma diminuição da sua forma ativa. A co-localização diminuída da Fyn com a mitocôndria correlaciona-se com a disfunção mitocondrial, morfologia alterada, e níveis aumentados de espécies reativas/oxidantes em diferentes modelos da HD. A expressão de SKF constitutivamente ativa, com o objetivo de restaurar os níveis ativos de SKF, melhoram a morfologia e a função mitocondrial, nomeadamente através da melhoria do potencial transmembranar mitocondrial, da respiração basal mitocondrial e produção de ATP, sem alterar a mitofagia. Além disso, a expressão ativa da SKF diminui os níveis de ROS em células que expressam mHtt e reduz o número de células apoptóticas associada a uma diminuição dos níveis reduzidos de caspase-3 ativa.Uma vez que a SKF apresenta um papel importante na modulação da atividade e localização dos NMDARs, analisámos em seguida o impacto dos níveis alterados da SKF, no contexto da HD, nos níveis sinápticos e extrassinápticos dos NMDARs. Exploramos o impacto dos níveis de Fyn na PSD e o seu papel na função e localização alterada dos NMDARs, assim como a ativação de vias neuroprotetoras intracelulares, em neurónios estriatais primários do murganho YAC128. Mostramos que os níveis sinápticos reduzidos de Fyn estão relacionados com a diminuição da fosforilação dos NMDARs sinápticos, que contêm a subunidade GluN2B; concomitantemente, a atividade e correntes de NMDARs extrassinápticos aumentam, assim como uma diminuição da ativação de CREB e a indução de vias de morte celular. A expressão da forma constitutivamente ativa da SKF restabelece a localização, fosforilação e função de NMDARs na PSD. A reposição dos níveis ativados da SKF também promove a ativação do CREB e reduz a ativação de caspase-3. Este trabalho fornece informação importante sobre o envolvimento das cinases c-Src/Fyn na patogénese da HD, revelando um papel essencial da SKF na regulação do Nrf2, função mitocondrial e atividade de NMDARs na HD, potencialmente influenciando a progressão da doença, evidenciando estas cinases como possíveis novos alvos terapêuticos para a DH.

Huntington’s Disease (HD) is an autosomal-dominant neurodegenerative disorder with no effective therapies. The disease is caused by the extension of cytosine-adenine-guanine (CAG) repeats at the exon 1 of the huntingtin (HTT) gene. Mutant HTT (mHTT), the main HD proteinaceous hallmark, participates in reactive oxygen species (ROS) formation, reduced antioxidant proteins, altered protein degradation pathways, mitochondrial dysfunction and modified N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) activity. Importantly, two members of the Src Kinase Family (SKF), c-Src and Fyn, are activated by ROS, modulate pathways involved in antioxidant defense, have important roles in mitochondrial normal function and regulate NMDARs activity and localization. However, c-Src/Fyn involvement in HD is largely unexplored. In the present work, we investigate the involvement of SKF proteins in HD ethiopatogenesis in human and mouse models, as well as its possible involvement on redox changes, mitochondrial function and NMDAR postsynaptic density (PSD) location and related signaling. Previous studies in HD striatal cells showed increased ROS levels and reduced Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) protein levels despite increased phosphorylation/activation, being Nrf2 the main transcription factor involved in the expression of cell defense enzymes. Thus, in Chapter 3 we report increased Nrf2 phosphorylation at Ser40 along with enhanced SKF levels and phosphorylation/activation at Tyr416 following acute exposure of HT22 neural cells to hydrogen peroxide (H2O2). Cytosolic Nrf2 activation is modulated through phosphorylation by PKC, an enzyme controlled by SKF. Of relevance, Nrf2 phosphorylation at Ser40, its nuclear accumulation and transcriptional activity involving expression of heme oxygenase-1 (HO-1) are shown to be dependent on SKF activation. Moreover, modulation of Nrf2 activity by c-Src occurs through protein kinase C (PKC) phosphorylation at Tyr311. We demonstrate SKF-mediated regulation of Nrf2 transcriptional activity, via PKC activation, following an acute H2O2 stimulus. These data demonstrate the role of SKF, namely c-Src, in controlling Nrf2 activity and transcriptional activity under cellular oxidant conditions, common to several neurodegenerative disorders, as HD. Further studies were conducted to investigate SKF involvement in HD pathogenesis. In Chapter 4, we clearly show that c-Src and Fyn proteins are reduced in HD models, including postmortem human brain caudate, YAC128 mouse brain striatum and cortex at early stages, YAC128 striatal neurons and Q111 striatal cell lines. Reduced c-Src and Fyn protein levels in HD result from augmented degradation through autophagy in Q111 cells, and is accompanied by a decrease in c-Src/Fyn active form(s). Moreover, decreased Fyn mitochondrial co-localization correlates with HD-related mitochondrial dysfunction and altered morphology, and increased levels of reactive/oxidant species. Importantly, expression of constitutive active c-Src/Fyn aimed to restore active SKF levels improves mitochondrial morphology and function, namely through improved mitochondrial transmembrane potential, mitochondrial basal respiration and ATP production, but does not affect mitophagy. Additionally, constitutive active c-Src/Fyn expression diminishes the levels of reactive species in HD cells and reduces the number of apoptotic cells through reduced levels of active caspase-3.Since SKF have important roles in the modulation of NMDARs activity and localization, we next analyzed the impact of HD-mediated altered SKF levels on synaptic and extrasynaptic NMDARs (Chapter 5). Therefore, in the present study, we explore the impact of HD-mediated altered Fyn levels at post-synaptic density (PSD), and its role in distorted NMDARs function and localization, as well as in intracellular neuroprotective pathways in YAC128 mouse striatal neurons. We show that reduced synaptic Fyn levels and activity in HD striatal neurons is related with decreased phosphorylation of synaptic GluN2B-composed NMDARs; this occurs concomitantly with augmented extrasynaptic NMDARs activity and currents and reduced cAMP response element-binding protein (CREB) activation, along with induction of cell death pathways. Importantly, expression of the constitutive active form of SKF reestablishes NMDARs localization, phosphorylation and function at PSD in YAC128 mouse neurons. Enhanced SKF levels and activity also promotes CREB activation and reduces caspase-3 activation in YAC128 mouse striatal neurons. Overall, this work provides important insights about c-Src/Fyn kinases involvement in HD pathogenesis and discloses an essential role of SKF in regulating the transcription factor Nrf2, mitochondrial function and NMDARs activity in HD, potentially influencing disease progression, which evidence these kinases as possible novel HD therapeutical targets.