Preservação do potencial reprodutivo na doente oncológica: estimulação da angiogénese do enxerto de tecido ovárico criopreservado;

Abstract

Os avanços no diagnóstico e no tratamento do cancro aumentaram significativamente a esperança de vida das doentes oncológicas. No entanto, o tratamento oncológico é frequentemente gonadotóxico e pode induzir falência ovárica prematura e infertilidade. A criopreservação de tecido ovárico (TO) prévia à terapêutica oncológica tem-se revelado uma técnica promissora, já que após o transplante do TO é possível repor a função endócrina e a fertilidade. No entanto, uma das limitações desta técnica é a sua curta longevidade, devido a perda de mais de 50% dos folículos primordiais, condicionada pela isquemia que se verifica até ser estabelecida a revascularização do enxerto.A angiogénese é um processo complexo e fundamental em alguns processos da fisiologia da reprodução na mulher, nomeadamente no desenvolvimento folicular e na formação do corpo amarelo. A estimulação da angiogénese pode ser realizada através da utilização de fatores angiogénicos, designadamente o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF).O objetivo deste trabalho foi otimizar a função e a duração do enxerto de TO criopreservado, através do desenvolvimento de estratégias para melhorar a angiogénese.Em primeiro lugar, um modelo de cultura tridimensional (3D) com uma matriz de alginato foi comparado com a cultura convencional. O TO de rato pós-criopreservação foi mantido em cultura durante 72 horas. Posteriormente foi realizada a avaliação histológica e imunohistoquímica (IHQ) do tecido, com a análise dos folículos e do estroma e a quantificação da proliferação e da apoptose, bem como a avaliação da citotoxicidade pela quantificação de LDH no meio de cultura. Verificou-se mais degenerescência folicular, necrose e edema do tecido, bem como menor proliferação nas células do estroma na cultura 3D. Após 48 horas de cultura, a matriz de alginato não se revelou superior à cultura convencional. Porém, a matriz de alginato pode ser uma estratégia para avaliar o efeito de um estímulo terapêutico in vitro, uma vez que permite um maior contacto das moléculas com as células ou o tecido.Posteriormente foi validado o protocolo de criopreservação de TO para aplicação, em rato. Assim, foi comparado o TO fresco com o TO submetido a criopreservação lenta e descongelação, de acordo com o protocolo utilizado na prática clínica. O tecido também foi avaliado por histologia e IHQ, adicionando a análise da vascularização, bem como a realização de um array de angiogénese. Verificou-se que o protocolo utilizado não se mostrou deletério para o TO de rato, preservando a densidade folicular e a morfologia do TO, com diminuição da apoptose. Adicionalmente constatou-se um aumento da vascularização do TO após criopreservação, com alteração da expressão génica.Por fim, foram avaliados vários estímulos angiogénicos, nomeadamente o VEGF, o FGF e a hMG, com estudo in vitro e in vivo em modelo de rato, bem como a exposição in vitro do TO humano a exossomas.O efeito do VEGF, do FGF e da hMG foi estudado através da suplementação em cultura do TO de rato pós-criopreservação. Foi realizada a avaliação histológica e IHQ do tecido, bem como a avaliação da expressão génica no tecido e de angiopoietina-2 no meio de cultura. Tendo em conta os resultados do estudo in vitro, realizou-se o estudo in vivo com o autotransplante heterotópico de TO. A suplementação com hMG, isoladamente ou em associação a VEGF e a FGF, não condicionou a alteração da expressão dos genes relacionados com a foliculogénese e associou-se a maior proliferação no tecido, com a preservação dos folículos primordiais. Após o transplante, a suplementação tripla aumentou a densidade vascular, preservando a viabilidade do tecido. Neste trabalho experimental foi realizada, pela primeira vez, uma caracterização pormenorizada da expressão de genes relacionados com a angiogénese no TO após a cultura com os diferentes estímulos, tendo-se verificado a alteração da expressão de Col4a3, de Col18a1, de Egf, de Epas1, de FgFr-3, de Figf, de Hif1α, de Kdr e de Tie1.A cultura de TO pós-criopreservação com exossomas foi realizada pela primeira vez neste trabalho experimental, em que o TO humano foi avaliado por histologia e IHQ, como referido previamente, e por imunofluorescência para análise da internalização dos exossomas no TO. A aplicação in vitro de exossomas derivados de células mononucleares do cordão umbilical aumentou a área vascular no tecido, sendo uma estratégia promissora para melhorar a angiogénese do TO.Em suma, com este trabalho experimental foi possível desenvolver uma metodologia de cultura 3D de TO, validar o protocolo de criopreservação para aplicação em TO de rato e identificar diferentes estratégias para estimular a angiogénese no TO. Estes resultados permitem perspetivar trabalhos futuros, com o intuito translacional de melhorar a longevidade do transplante e otimizar a técnica de criopreservação de TO para preservação da fertilidade feminina.

Advances in cancer diagnosis and treatment have significantly increased the survival of cancer patients. However, cancer treatment is often gonadotoxic and can induce premature ovarian failure and infertility. Ovarian tissue (OT) cryopreservation prior to cancer therapy has proved to be a promising technique, since endocrine function and fertility can be restore after OT transplantation. However, one of the limitations of this technique is its short longevity, due to the loss of more than 50% of primordial follicles, influenced by the ischaemia that occurs until graft revascularization is established.Angiogenesis is a complex and fundamental process in the physiology of reproduction in women, namely in follicular development and in the formation of the corpus luteum. Stimulation of angiogenesis can be performed using angiogenic factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF).The objective of this work was to optimize the function and duration of cryopreserved OT graft, by developing strategies to improve angiogenesis.First, a three-dimensional (3D) culture model with an alginate matrix was compared with the conventional culture. Post-cryopreservation rat OT was maintained in culture for 72 hours. Subsequently, the histological and immunohistochemical (IHC) evaluation of the tissue was performed, with the analysis of follicles and stroma and the quantification of proliferation and apoptosis, as well as the evaluation of cytotoxicity by quantification of LDH in the culture medium. There was greater follicular degeneration, tissue necrosis and oedema, as well as less proliferation in stromal cells in the 3D culture. After 48 hours of culture, the alginate matrix did not prove to be superior to the conventional culture. However, the alginate matrix can be a strategy to evaluate the effect of a therapeutic stimulus in vitro since it allows greater contact of the molecules with cells or tissue.Subsequently, the OT cryopreservation protocol was validated for application in rats. Thus, fresh OT was compared with OT submitted to slow cryopreservation and thawing, according to the protocol used in clinical practice. The tissue was also evaluated by histology and IHC, adding vascularization analysis, as well as performing an angiogenesis array. It was found that the protocol used was not deleterious to rat OT and preserved the follicular density and OT morphology, with decreased apoptosis. Additionally, an increase in OT vascularization was observed after cryopreservation, with altered gene expression.Finally, several angiogenic stimuli were evaluated, namely VEGF, FGF and hMG, with an in vitro and in vivo study in a rat model, as well as the in vitro exposure of human OT to exosomes.The effect of VEGF, FGF and hMG was studied through the supplementation in culture of the post-cryopreservation rat OT. Histological and IHC evaluation of the tissue was performed, as well as the evaluation of gene expression in the tissue and of angiopoietin-2 in the culture medium. Considering the results of the in vitro study, the in vivo study was carried out with the heterotopic autotransplantation of TO. Supplementation with hMG, alone or in association with VEGF and FGF, did not affect the expression of genes related to folliculogenesis and was associated with greater proliferation in the tissue, with preservation of primordial follicles. After transplantation, triple supplementation increased vascular density while preserving tissue viability. In this experimental work, for the first time, a detailed characterization of the expression of genes related to angiogenesis in the OT after culture with the different stimuli was performed, with alteration of the expression of Col4a3, Col18a1, Egf, Epas1, FgFr-3, Figf, Hif1a, Kdr and Tie1 being found.Post-cryopreservation OT culture with exosomes was performed for the first time in this experimental work, in which, as previously mentioned, human OT was evaluated by histology and IHC and by immunofluorescence to analyse the internalization of exosomes in OT. The in vitro application of exosomes derived from umbilical cord mononuclear cells increased the vascular area in the tissue and is a promising strategy for improving OT angiogenesis.In short, by means of this experimental work, it was possible to develop a methodology for 3D OT culture, to validate the cryopreservation protocol for application in rat OT and to identify different strategies to stimulate angiogenesis in OT. These results allow us to predict future work, with the translational aim of improving the longevity of the transplant and optimizing the OT cryopreservation technique for the preservation of female fertility.