Biochemical and structural studies of a novel glucosamine kinase and a unique glycosyltransferase: new antimicrobial opportunities in actinobacterial glycobiology

Abstract

O surgimento e disseminação de mecanismos de resistência antimicrobiana, incluindo contra antibióticos de última linha, juntamente com décadas de desinvestimento na descoberta e desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos para reforçar o nosso arsenal terapêutico, estão a criar uma tempestade perfeita que ameaça muitas das conquistas em que a medicina moderna assenta. Apesar de reconhecida como uma das mais sérias ameaças à saúde global pela Organização Mundial de Saúde, ainda há muito por fazer para responder a esta crise, desde intensificar a investigação fundamental na área a adoptar políticas eficazes. No que respeita à investigação fundamental, um grupo de bactérias, os actinomicetos, destaca-se como sendo de interesse especial por conter tanto produtores prolíficos de antibióticos, os streptomicetos, como alguns dos mais ameaçadores e resistentes agentes patogénicos, as micobactérias. Sendo os actinomicetos uma fonte de problemas, mas também de soluções, é fundamental estudar a sua fisiologia e metabolismo e, em particular, a sua glicobiologia já que tanto os aspectos benéficos como os ligados à sua patogenicidade dependem em grande parte dos carboidratos únicos que produzem.Ao estudar um gene duplicado da maltocinase, uma enzima envolvida na biossíntese de α-1,4-glucanos através de uma via não-canónica que tem atraído interesse como potencial alvo terapêutico nas micobactérias, identificámos uma família nova de glucosamina cinases (GlcNK). A distribuição filogenética surpreendente do gene que codifica esta GlcNK sugeriu ligações ao metabolismo secundário, levando-nos a focar no homólogo de Streptacidiphilus jiangxiensis, membro de uma família prolífica de produtores de antibióticos. A sua caracterização estrutural mostrou detalhes do mecanismo catalítico desta nova família de GlcNK, e análises bioinformáticas do cluster biossintético a que pertence revelaram pistas da sua participação na produção de um metabolito secundário único e com potencial actividade microbiana. Também em relação à biossíntese de α-1,4-glucanos em micobactérias, investigámos a enzima glicosil-3-phosphoglicerato sintase (GpgS), que catalisa o primeiro passo da via de biossíntese dos lipopolissacáridos de metilglucose (MGLP). Esta enzima tem sido amplamente estudada e tem despertado interesse enquanto potencial alvo terapêutico, mas até à data faltavam estruturas 3D de alta resolução para guiar esforços de desenho racional de fármacos. Após demonstrar que a micobactéria Mycobacterium hassiacum é um termófilo genuíno e prever que seria uma fonte de proteínas estáveis, foi possível obter estruturas de alta resolução da sua GpgS, que permitem conhecer melhor detalhes do local activo desta importante enzima e sugerem ligações intrigantes a outras vias metabólicas cruciais, incluindo a via de biossíntese do ácido fólico, conhecida por ser o alvo de importantes compostos antimicrobianos.Assim, os resultados apresentados neste trabalho exemplificam como o estudo da glicobiologia dos actinomicetos pode, por vezes de forma inesperada, abrir novos caminhos de investigação e estimular a descoberta de novas estratégias antimicrobianas.

The emergence and spread of antimicrobial resistance mechanisms, including against last-line antibiotics, coupled with decades of disinvestment in the discovery and development of new antimicrobials to replenish our arsenal, is creating a perfect storm that threatens many of the achievements on which modern medicine relies. Despite being recognised as one of the most serious global health threats by the World Health Organisation, there is still a lot to be done to tackle this crisis, from intensifying basic research on the subject to adopting effective policies. From a basic research point of view, one group of bacteria, commonly called actinomycetes, stands out as particularly interesting to study since it comprises both prolific antibiotic producers, streptomycetes, and some of the most threatening antibiotic-resistant pathogens, mycobacteria. Since actinomycetes are a source of problems but can also offer solutions, understanding their physiology and metabolism is critical. Their glycobiology is of special interest, given that both the beneficial and pathogenic sides of actinomycetes are tightly linked to the unique sugar-containing molecules they produce.While pursuing the characterisation of a duplicate gene of the mycobacterial maltokinase, an enzyme involved in α-1,4-glucan biosynthesis through a non-canonical pathway which has attracted significant interest as a potential drug target in mycobacteria, we identified a novel family of actinobacterial glucosamine kinases (GlcNK). The phylogenetic distribution of the gene encoding this GlcNK was surprising and suggested links to secondary metabolism, leading us to focus on the homologue from Streptacidiphilus jiangxiensis, member of a prolific family of antibiotic producers. Its structural characterisation unveiled details of the catalytic mechanism of this novel family of glucosamine kinases, while bioinformatic analyses of the oddly structured biosynthetic gene cluster it belongs to revealed hints of its participation in the biosynthesis of a unique secondary metabolite with potential antimicrobial activity. Within the topic of α-1,4-glucan biosynthesis in mycobacteria, another enzyme was also investigated, glucosyl-3-phosphoglycerate synthase (GpgS), which catalyses the first committed step in the biosynthesis of the unique intracellular methylglucose lipopolysaccharides (MGLP). GpgS has been extensively studied and has garnered interest as a potential drug target, but high-resolution 3D structures, essential to guide rational drug design efforts, were still missing. After establishing Mycobacterium hassiacum as a genuine thermophilic species of mycobacteria and predicting it to be a source of stable mycobacterial proteins, high-resolution structures of its GpgS homologue were successfully obtained. These structures not only provided new insights into the active site of this important enzyme, but also suggested intriguing and yet unsuspected links with other crucial metabolic pathways, including the folate pathway, the target of many important antimicrobials.The results presented in this work demonstrate how studying the glycobiology of actinomycetes can, sometimes unexpectedly, open new avenues of research with the potential to spur the discovery of novel antimicrobial strategies.