Role of SP1 and PADI2 during Oligodendocyte Diffferentiation Enhanced by Mechanotransduction

Abstract

Oligodendrocytes (OLs) are the myelinating cells in the central nervous system (CNS), providing insulation of axons to accelerate the transmission of action potentials. Oligodendrocyte precursor cells arise during embryonic development while the myelination process only occurs at post-natal stages. These processes are tightly regulated by several molecular players — hormones and growth factors. The loss of myelin sheaths can cause anomalous nerve transmission and neuronal death as occurs in demyelinating diseases, such as multiple sclerosis (MS).Multiple sclerosis is an autoimmune neurological disease where OLs are lost by immune cells attack. The formation of new myelin — remyelination — occurs at the initial stages of the disease, nevertheless, this process may fail for reasons yet unclear. One possible reason is changes in the extracellular milieu, for instance in the stiffness and extracellular matrix composition, as a particular balance of extracellular composition and rigidity is required for effective myelination and remyelination. Regarding extracellular stiffness, there are some reports demonstrating that brain stiffness changes in MS patients, being softer when compared to age-matched healthy controls. Currently, it has been demonstrated that mechanical cues such as stiffness and spatial constraints, play a major role in OL differentiation in vitro. We demonstrated that substrates compliant with rat/mouse brain stiffness promote OL differentiation, while OL differentiation is compromised on softer or stiffer substrates.Mechanical forces affect OL differentiation, though, the underlying mechanisms are yet to elucidate. This work proposed to explore the role of Specificity protein 1 (Sp1), Peptidyl Arginine Deiminase 2 (Padi2), RhoA, and chromatin accessibility in OL differentiation potentiated by mechanotransduction. A broad analysis of chromatin accessibility was performed in OLs differentiated on: i) soft, ii) mouse brain-compliant and iii) stiff substrates using Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq).The ATAC-seq results revealed higher chromatin accessibility on stiff and soft substrates than on mouse brain-compliant substrates, this can be related with an enhancement of differentiation on brain-compliant substrates — during OL differentiation the heterochromatin content (less accessible regions) increase. The more accessible regions in all conditions displayed footprints of Sp1 binding a mechanosensitive transcription factor (TF) previously described to have a role in OL differentiation. Here we demonstrated that Sp1 nuclear translocation increases when OLs were cultured on mouse brain-compliant substrates. Moreover, the inhibition of Sp1 decreases the expression of MBP (a marker of OL differentiation). As such we have identified Sp1 as a regulator of OL differentiation whose activity is influenced by mechanical stiffness of the cell culture substrate.Differentiation of OLs is modulated by several players. Recently, Padi2 was identified as a novel player of OL differentiation and myelination. Padi2 seems to have a dual role on OL biology — it acts as an OL differentiation promoter and as a trigger for MS development. Here, we found that Padi2 expression increased on mouse brain-compliant substrates, and in its absence, Mbp expression decreased. Moreover, Padi2 seems to regulate RhoA expression and activity that plays a crucial role in OL differentiation.One of the major problems in MS is the lack of therapeutics to promote remyelination. We hypothesized that brain stiffness alterations can be one of the causes of remyelination failure since brain softens during MS. Such alterations can be corelated with a reduced RhoA activity, which changes accordingly to substrate stiffness (higher stiffness increases RhoA activity and lower stiffness decreases). Thus, here we assessed the effect of RhoA activators on soft substrates (that potentially mimic brain softening, and reduced RhoA activity) and the effect of RhoA inhibitors on stiff substrates which exhibit an increased RhoA activity. The pharmacological activation of RhoA on soft substrates and, conversely, its inhibition on stiff substrates, rescued the expression of Mbp. These data reveal that RhoA can be a promising target for MS therapeutics.The data presented in this work reveals the importance of using cell culture conditions mimicking in vivo tissue stiffness to study MS-like extracellular matrices. Furthermore, these data can be used for the development of new therapeutic drugs for MS.

Oligodendrócitos (OLs) são células responsáveis pela mielinização do sistema nervoso central, aprovisionando isolamento aos axónios para que a transmissão de potenciais de ação seja acelerada. O desenvolvimento de OLs inicia-se durante o desenvolvimento embrionário, posteriormente a mielinização ocorre em estádios pós-natais. Estes processos são rigorosamente regulados por diferentes moléculas — hormonas e fatores de crescimento. A perda de mielina pode causar uma transmissão nervosa anómala e morte neuronal, como ocorre em doenças desmielinizantes, tais como esclerose múltipla (EM).A EM é uma doença neurológica autoimune caracterizada pela perda de OLs ao serem atacadas por células do sistema imunitário. A formação de nova mielina — remielinização — ocorre nos estágios iniciais da doença, mas a remielinização pode falhar por razões ainda desconhecidas. Uma das possíveis causas é a alteração do microambiente extracelular — rigidez e composição da matriz extracelular —, uma vez que a eficácia do processo de mielinização e remielinização está dependente de um equilíbrio da composição e rigidez da matriz extracelular. Relativamente à rigidez extracelular, existem alguns estudos que demonstram alterações da rigidez cerebral em pacientes com EM — pacientes com EM apresentam um grau de rigidez cerebral mais baixo quando comparados com controlos saudáveis na mesma faixa etária. Atualmente, tem sido demonstrado que elementos mecânicos, tais como: rigidez e restrição espacial desempenham um papel importante na diferenciação de OLs in vitro. Nós demonstrámos que a diferenciação de OLs é promovida quando as células são cultivadas em substratos complacentes com o grau de rigidez do cérebro de rato/ratinho, enquanto substratos mais rígidos ou de rigidez mais baixa comprometem a diferenciação de OLs.As forças mecânicas afetam a diferenciação de OLs, contudo os mecanismos envolvidos ainda não estão completamente elucidados. Neste trabalho propusemos explorar os papéis do Sp1, Padi2, RhoA e da acessibilidade da cromatina na diferenciação de OLs. Foi realizada uma análise ampla de acessibilidade da cromatina — ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível por transposase com sequenciamento de alto rendimento) — em OLs diferenciados em substratos de baixa rigidez, complacentes com a rigidez do cérebro de ratinho e de alta rigidez.Os resultados de ATAC-seq revelaram uma maior acessibilidade da cromatina em substratos de alta e baixa rigidez quando comparados com substratos complacentes com a rigidez de cérebro de ratinho. As regiões mais acessíveis em todas as condições tinham locais de ligação para Sp1, fator de transcrição relevante para a diferenciação de oligodendrócitos. O fator de transcrição Sp1 é mecano-sensível, nós demonstrámos que há uma maior translocação nuclear de Sp1 quando OLs são diferenciados em substratos complacentes com o grau de rigidez do cérebro de ratinho. Além disso, a inibição de Sp1 reduz a expressão de MBP (marcador da diferenciação de OLs). Neste trabalho, identificámos o Sp1 como regulador da diferenciação cuja atividade é influenciada por rigidez mecânica. Recentemente foi identificada a proteína Peptidil Arginina Deiminase 2 (Padi2) como um novo fator que afeta a diferenciação de oligodendrócitos e a mielinização. A Padi2 parece ter um papel duplo na biologia de OLs — promotor da diferenciação de OLs e como um gatilho para o desenvolvimento de EM. Nós observámos um maior nível de expressão de Padi2 em substratos complacentes com o grau de rigidez do cérebro, e na ausência de Padi2 a expressão de Mbp é reduzida. Adicionalmente, a Padi2 parece regular a expressão de RhoA e a sua atividade, a qual tem um papel importante na diferenciação de OLs. Um dos maiores desafios no tratamento de EM é a falta de moléculas que promovam a remielinização. Nós consideramos que as alterações de rigidez do cérebro possam ser uma das causas para a falha de remielinização. Estas alterações de rigidez podem ser relacionadas com a atividade da RhoA. Por isso, neste trabalho foi avaliado o efeito de ativadores da RhoA em substratos de baixa rigidez (que potencialmente mimetizam a diminuição de rigidez cerebral observada em EM, com diminuição da atividade da RhoA) e, testámos o efeito de inibidores da RhoA em substratos mais rígidos (a alta rigidez aumenta a atividade da RhoA). O aumento induzido por vias farmacológicas da ativação da RhoA em substratos de baixa rigidez, tal como a diminuição dessa mesma atividade em substratos de alta rigidez, levaram a um aumento de expressão de Mbp. Estes dados revelaram que a RhoA pode ser utilizada como um alvo promissor para a terapia de EM.Os dados apresentados neste trabalho reforçam a importância do uso de condições de cultura que mimetizem as condições de rigidez dos tecidos in vivo. Para além disso, estes dados podem ser úteis para o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas para EM.