Deciphering the functions of NDR kinases as novel players in the regulation of microglia.

Abstract

Diabetic retinopathy is a severe complication of diabetes and a leading cause of visual impairment worldwide, predominantly affecting the working-age population. It is well established that chronic hyperglycemia plays a critical role in the pathogenesis of diabetic retinopathy, triggering an array of cellular responses within the retina. One of the key players involved in the retinal response against stress, such as chronic hyperglycemia, is microglia. Microglia are a type of cell that becomes activated in response to various pathological stimuli and can exert both neuroprotective and neurodegenerative effects. The NDR (Nuclear Dbf2-Related) kinases have emerged as crucial regulators of cell growth, survival, and migration in numerous biological contexts. Recent studies have implicated NDR kinases in neuroinflammation and neurodegenerative diseases, pointing to their potential involvement in the pathophysiology of diabetic retinopathy. However, the precise role of NDR kinases in the context of retinal microglial responses and hyperglycemic environments remains largely unexplored. To address this gap, our study sought to investigate the effects of high glucose (HG) exposure on BV-2 microglial cells, with a specific focus on the role of NDR kinases in this process. BV-2 cells were chosen as an established in vitro model to study microglial responses, and by subjecting them to HG exposure, we aimed to mimic the hyperglycemic environment that occurs in diabetes. The cells were incubated with HG for different timepoints: 4h HG incubation (4h assay), 7h HG incubation (7h assay), two times 4h HG incubations with a 4h incubation break in between with normal glucose (12h assay) and then different assays were performed to address the main question. Additionally, we conducted a CRISPR-Cas9 lipofectamine transfection to induce a knockout of Ndr2 in BV-2 cells in order to understand the role of NDR2 kinase in microglial cells in the context of diabetes. Ultimately, an STZ-induced diabetic mouse model was used to evaluate the differences in retinal Ndr2 expression when compared to a non-diabetic animal.Our findings highlight that NDR kinases are expressed in BV-2 microglial cells and that expression is impacted by exposure to acute levels of high glucose. Protein levels of NDR1/2 exhibited a reduction in BV-2 cells subjected to the 7h assay, yet they exhibited an increase when exposed to the 12h assay. The same pattern was observed for Ndr2 mRNA expression, suggesting that during the 4h break between HG exposures, the cells might activate compensatory mechanisms to mitigate the adverse effects of HG-induced stress. Conversely, such mechanisms might be inhibited during extended HG exposure periods (7h). Furthermore, our study demonstrates that Ndr2 downregulation influences phagocytosis, a main function of microglial cells. Moreover, we confirmed the influence of the glycemic environment on the phagocytic activity of the microglial cells even in short-term exposures. For WT BV-2 cells, an increase was observed in the 4h assay, while in the 12h assay, phagocytic efficacy decreased. Nevertheless, the phagocytic activity of Ndr2 downregulated BV-2 cells was inherently less responsive to changes in glucose concentrations. This outcome can be a result of Ndr2 downregulation, but additional experiments are necessary given the potential influence of alternate signaling pathways on phagocytosis regulation. We also observed that HG exposure and Ndr2 downregulation lead to the expression of TNF-α and IL-17a, suggesting that NDR2 kinase is involved in the immune response mediated by microglial cells. Lastly, NDR2 expression in STZ-induced diabetic mice was observed in the inner plexiform layer, whereas in non-diabetic mice, the expression is in all layers of the retina, from the outer nuclear layer to the inner plexiform layer, suggesting that NDR kinases may have a role in modulating synaptic function and, consequently, the processing of visual information.In conclusion, this study reveals that NDR2 might play an important role in diabetic retinopathy, affecting microglial cells and contributing to the retinal changes observed in diabetic patients. It also underscores the importance of further research to unravel the intricate connections between NDR kinases and microglial responses. Ultimately, deciphering these molecular mechanisms may pave the way for novel genetic testing or therapeutic strategies aimed at mitigating the effects of diabetic retinopathy and improving visual outcomes for affected individuals.

A retinopatia diabética é uma complicação grave da diabetes e uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo. Vários estudos reportam que a hiperglicemia crónica desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da retinopatia diabética e desencadeia vários processos celulares na retina em resposta a stress. As células da microglia são um tipo de células que são ativadas em resposta a vários estímulos patológicos e que tanto podem exercer efeitos neuroprotetores como neurodegenerativos. Estas células são consideradas os principais mediadores na resposta da retina a condições de stress. As cinases NDR (Nuclear Dbf2-Related) têm surgido como reguladores cruciais do crescimento, sobrevivência e migração celular em vários contextos biológicos. Estudos recentes indicam que as cinases NDR estão envolvidas em processos de neuroinflamação e em doenças neurodegenerativas, o que reforça o seu potencial envolvimento na fisiopatologia da retinopatia diabética. No entanto, o papel exato destas cinases na resposta da microglia a condições de hiperglicemia permanece bastante inexplorado.Para colmatar esta lacuna, o nosso estudo tem por base a investigação dos efeitos da exposição a níveis elevados de glucose (HG) nas células da microglia e o papel das cinases NDR ao longo desse processo. A linha celular BV-2 foi escolhida como um modelo in vitro para estudar as respostas da microglia e, ao submetê-las à exposição a elevados níveis de glucose, pretendemos reproduzir o ambiente hiperglicémico característico da diabetes. Para isso as células foram incubadas com HG durante diferentes períodos de tempo: 4h de incubação com HG (ensaio de 4h), 7h de incubação com HG (ensaio de 7h), duas incubações de 4h com HG com um intervalo de 4h de exposição, entre as mesmas, a níveis normais de glucose (ensaio de 12h). De seguida, foram efetuados diferentes ensaios de modo a responder à principal questão deste estudo. Além disso, utilizámos a técnica CRISPR-Cas9 para induzir um knockout do gene Ndr2 em células BV-2, com o intuito de compreender a função da cinase NDR2 em células da microglia e num contexto de diabetes. Por fim, utilizamos um modelo de murganho diabético, induzido por STZ, para avaliar as diferenças na expressão de Ndr2 na retina quando comparado com um animal não diabético.Os nossos resultados indicam que, de facto, as cinases NDR são expressas em células BV-2 e que essa expressão é afetada pela exposição aguda a elevados níveis de glucose. Os níveis de expressão das proteínas NDR1/2 apresentaram uma redução nas células BV-2 submetidas ao ensaio de 7 horas, mas, por outro lado, foi observado um aumento de expressão quando as células foram submetidas ao ensaio de 12 horas. O mesmo padrão foi observado para a expressão de mRNA de Ndr2, o que sugere que, durante o intervalo de 4 horas entre as exposições a elevados níveis de glucose, as células podem ativar mecanismos de compensação para atenuar os efeitos adversos provocados pela glucose. No entanto, esses mecanismos podem ser inibidos durante períodos mais prolongados de exposição a HG (7h). Além disso, o nosso estudo demonstra que a regulação negativa de Ndr2 influencia a fagocitose, uma das principais funções das células da microglia. Confirmamos também que um ambiente hiperglicémico tem impacto na atividade de células da microglia durante pequenos períodos de incubação. Para as células WT BV-2, foi observado um aumento no ensaio de 4 horas, enquanto no ensaio de 12 horas a atividade fagocitária diminuiu. A fagocitose das células BV-2 com regulação negativa de Ndr2 foi inerentemente menos reativa a alterações nas concentrações de glucose. Este resultado pode ser consequência da desregulação do Ndr2, mas são necessários ensaios adicionais, dada a possível influência de vias de sinalização alternativas na regulação da fagocitose. Também verificámos que a exposição a elevados níveis de glucose e uma regulação negativa de Ndr2 promovem a expressão de TNF- e IL-17a, sugerindo que a cinase NDR2 tem um papel na resposta imune. Por último, a expressão de NDR2 em murganhos diabéticos foi observada na camada plexiforme interna, enquanto em ratinhos não diabéticos, a expressão está presente em todas as camadas da retina, desde a camada nuclear externa até à camada plexiforme interna, sugerindo que as cinases NDR podem ter um papel negativo na regulação da função sináptica e, consequentemente, no processo de informação visual.Em suma, este estudo revela que NDR2 poderá ter um papel fundamental na retinopatia diabética, afetando as células da microglia e contribuindo para as alterações na retina observadas em doentes diabéticos. É importante ressaltar que são necessários mais ensaios para clarificar as possíveis ligações entre as cinases NDR e as respostas da microglia. Em última análise, a compreensão destes mecanismos moleculares poderá abrir caminho para novas estratégias terapêuticas destinadas a atenuar os efeitos da retinopatia diabética.