Relação genótipo-fenótipo nas patologias de membrana do glóbulo vermelho

Abstract

Introdução: A membrana eritrocitária é responsável pelas características mecânicas, transporte iónico e diversidade antigénica do glóbulo vermelho (GV). É composta por aproximadamente 20 proteínas principais e por, pelo menos, 850 proteínas menores. A manutenção da integridade estrutural da membrana é essencial para que o eritrócito desempenhe as suas funções sem ser prematuramente destruído ou sequestrado pelo baço. As membranopatias (Esferocitose, Eliptocitose, Xerocitose e Piropoiquilocitose) são a causa mais comum de anemia hemolítica congénita e são fenotípica e genotipicamente muito heterogéneas. Os genes descritos em associação com patologia de membrana do eritrócito são o ANK1(anquirina), SLC4A1(banda 3), SPTA1(α-espectrina), SPTB (β-espectrina), PIEZO1(canal piezo 1), EPB41(proteína 4.1), EPB42(proteína 4.2), KCNN4 (canal gardos), GYPC (glicoforina C) e RHAG (glicoproteína ligada ao grupo Rh). Existem variantes benignas no gene SPTA1 chamados de alelos de baixa expressão (Lely, Lepra e Prague), com alta frequência na população, que condicionam uma diminuição da proteína α-espectrina; a mais abundante do citoesqueleto da membrana do eritrócito. O estudo molecular é de grande importância uma vez que os critérios de transmissibilidade genética, bem como o impacto dos defeitos genéticos na integridade da membrana, carecem ainda de evidências; e por outro lado, juntamente com os estudos funcionais e dados clínicos, permitem clarificar a relação genótipo-fenótipo nestas patologias.Objetivos: Fazer a caracterização molecular de doentes com anemia hemolítica e suspeita de defeito da membrana do GV, utilizando um painel de Next Generation Sequencing (NGS) desenhado para anemias hemolíticas e utilizar os perfis de ectacitometria para traçar uma relação genótipo-fenótipo nestas patologias. Material e métodos: Foram estudadas 45 amostras de doentes com suspeita de defeito da membrana do GV e anemia autoimune descartada por teste de Coombs negativo. Foram observados os esfregaços de sangue periférico (ESP) e realizados testes funcionais (ectacitometria e crioteste). Utilizou-se um painel de NGS concebido para anemias hemolíticas para fazer a caracterização molecular das amostras. A sequenciação de Sanger foi utilizada para confirmar as variantes encontradas nos doentes e para os estudos familiares. Foram também pesquisados os polimorfismos de baixa expressão nos doentes e familiares com variantes patogénicas no gene SPTA1.Resultados e discussão: Foram identificadas 35 variantes, distribuídas por 6 dos genes descritos em associação com patologia de membrana do eritrócito (ANK1, SPTB, SPTA1, SLC4A1, PIEZO1 e EPB41). Apenas em 11 casos não se identificaram variantes patogénicas ou provavelmente patogénicas que justifiquem o fenótipo e 19 das variantes encontradas não se encontram ainda descritas. Do estudo comparativo das curvas de ectacitometria obtidas foi possível estabelecer um padrão para cada tipo de membranopatia. As esferocitoses apresentaram uma curva com EImáx diminuído e Ohyper aumentado ou normal, as eliptocitoses apresentaram EImáx diminuído e um perfil achatado e as Xerocitoses uma curva deslocada à direita, com EImáx normal e Omáx e Ohyper diminuídos. Os outros estudos funcionais, crioteste e EMA não mostraram ser tão eficazes no diagnóstico diferencial das membranopatias.Conclusões: Num estudo com 45 amostras, encontrar mais de 50% de variantes não descritas e, adicionalmente, a caracterização molecular revelar grande heterogeneidade para pacientes com fenótipos semelhantes, torna evidente a importância de uma avaliação genética mais abrangente. A utilização de painéis de NGS nestas patologias irá trazer maior conhecimento dos padrões genéticos e do espectro de variantes genéticas, para ajudar no diagnóstico de membranopatias do GV. O estudo por ectacitometria demonstrou ser útil no diagnóstico diferencial das membranopatias, e um método mais rápido e útil para identificar xerocitoses principalmente quando a esplenectomia é uma opção de tratamento.

Introduction: The erythrocyte membrane is responsible for the mechanical characteristics, ion transport and antigenic diversity of the red blood cell (RBC). It is composed of approximately 20 major proteins and at least 850 minor proteins. Maintaining the structural integrity of the membrane is essential for the erythrocyte to fulfil its functions without being prematurely destroyed or sequestered by the spleen. Membranopathies (Spherocytosis, Elliptocytosis, Xerocytosis and Pyropoxycytosis) are the most common cause of congenital haemolytic anaemia and are phenotypically and genotypically very heterogeneous. Genes described in association with erythrocyte membrane pathology are ANK1(ankyrin), SLC4A1(band 3), SPTA1(α-spectrin), SPTB (β-spectrin), PIEZO1(piezo channel 1), EPB41(protein 4.1), EPB42 (protein 4.2), KCNN4 (gardos channel), GYPC (glycophorin C) and RHAG (Rh group-linked glycoprotein). There are benign variants in the SPTA1 gene called low expression alleles (Lely, Lepra and Prague), with high frequency in the population, which condition a decrease in the α-spectrin protein; the most abundant of the erythrocyte membrane cytoskeleton. The molecular study is of great importance since the criteria of genetic transmissibility, as well as the impact of genetic defects on membrane integrity, still lack evidence; and on the other hand, together with functional studis and clinical information, they allow to clarify the genotype-phenotype relationship in these pathologies.Aims: To perform molecular profiling of patients with haemolytic anaemia and suspected GV membrane defects, using a Next Generation Sequencing (NGS) panel designed for haemolytic anaemias and to use ectacytometry profiles to trace a genotype-phenotype relationship in these pathologies. Material and methods: 45 samples from patients with suspected GV membrane defect and autoimmune anaemia ruled out by negative Coombs test were studied. Peripheral blood smears (PBS) were observed and functional tests (ectacytometry and cryotest) were performed. An NGS panel designed for haemolytic anaemias was used to perform molecular characterisation of the samples. Sanger sequencing was used to confirm variants found in patients and for family studies. Low-expression polymorphisms in patients and relatives with pathogenic variants in the SPTA1 gene were also searched for.Results and discussion: 35 variants were identified, distributed over 6 of the genes described in association with erythrocyte membrane pathology (ANK1, SPTB, SPTA1, SLC4A1, PIEZO1 and EPB41). Only in 11 cases were no pathogenic or probably pathogenic variants identified to justify the phenotype and 19 of the variants found are not yet described. The comparative study of the ectacytometry curves obtained enabled a pattern to be established for each type of membranopathy. Spherocytoses present a curve with decreased EImáx and increased or normal Ohyper, elliptocytoses present decreased EImáx and a flattened profile and xerocytoses a curve shifted to the right, with normal EImáx and decreased Omax and Ohyper. The other functional studies, cryotest and EMA did not prove to be as effective in the differential diagnosis of membranopathies.Conclusions: In a study with 45 samples, finding more than 50% of undescribed variants and, additionally, the molecular characterisation revealing great heterogeneity for patients with similar phenotypes, makes evident the importance of a more comprehensive genetic evaluation. The use of NGS panels in these pathologies will bring greater knowledge of genetic patterns and the spectrum of genetic variants to aid in the diagnosis of GV membranopathies. Ectacytometry study has proven to be useful in the differential diagnosis of membranopathies, and a faster method to identify xerocytosis when splenectomy is a treatment option.