Análise da expressão génica do HIF-1α e genes-alvo e de citocinas pró-inflamatórias na periodontite e diabetes mellitus tipo 2

Abstract

A Periodontite (PDT) e a Diabetes Mellitus tipo 2 (T2D) são doenças imunoinflamatórias e como tal partilham vários mecanismos patológicos, sendo consensual a existência de uma relação bidirecional entre estas duas entidades. O desenvolvimento de hipóxia tecidular e a ativação do inflamassoma NLRP3 com produção de citocinas inflamatórias estão associados a ambas as comorbilidades e poderão constituir um elo entre a PDT e a T2D. Este estudo teve como objetivo determinar os níveis de expressão do HIF-1α e dos seus genes-alvo, nomeadamente o VEGF-A, Glut1 e ADM, assim como a expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e IL-18, associadas ao inflamassoma NLRP3 (do inglês “NOD-, LRR- and pyrin domain-containing 3”) em células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, do inglês “peripheral blood mononuclear cells”) de doentes com PDT, T2D e com as duas comorbilidades, comparativamente a indivíduos saudáveis. Após o isolamento das PBMCs, foram submetidas a extração de RNA e, em seguida, à conversão em cDNA. Por fim, quantificaram-se os níveis de mRNA através de PCR quantitativo em tempo-real. Os nossos resultados mostraram uma diminuição dos níveis de mRNA de HIF-1α e VEGF-A em doentes com PDT e uma diminuição dos níveis de mRNA de HIF-1α nos doentes PDT-T2D, comparativamente aos T2D; observou-se também uma diminuição significativa nos níveis de expressão génica do Glut1 no grupo PDT-T2D, em comparação com o grupo PDT e T2D; adicionalmente, detetou-se um aumento dos níveis de mRNA da ADM nos participantes do grupo T2D e uma diminuição significativa entre os grupos T2D e PDT-T2D. A análise das citocinas pró-inflamatórias permitiu detetar um aumento nos níveis de expressão da pro-IL-1β nos participantes do grupo T2D, mas a ausência de diferença entre os níveis de expressão da pro-IL-18 dos grupos PDT, T2D, PDT-T2D, relativamente ao grupo controlo. A análise de correlação dos parâmetros investigados permitiu detetar uma correlação forte entre os níveis de mRNA de HIF-1α e de VEGF-A, ADM e pro-IL-1β e uma correlação muito forte entre os níveis de mRNA da ADM e da pro-IL-1β; uma correlação moderada entre os níveis de mRNA da ADM e da pro-IL-1β com a HbA1c; e uma correlação moderada entre a expressão do HIF-1α e do VEGF-A com os parâmetros periodontais CAL e PD. Com base nestes dados podemos concluir que os doentes com PDT apresentam uma diminuição da expressão génica tanto do HIF-1α como do VEGF-A e, por outro lado, os doentes com T2D apresentam uma maior expressão da ADM e da pro-IL-1β, o que pode sugerir mecanismos de atuação diferentes destas moléculas na PDT e na T2D. A definição de mecanismos celulares associados à PDT e T2D poderá ser importante na identificação de alvos terapêuticos mais eficazes para estas duas patologias e para as situações de PDT-T2D.

Periodontitis (PDT) and Type 2 Diabetes Mellitus (T2D) are immunoinflammatory diseases that have several pathological mechanisms in common, while a bidirectional relationship between them has been described. The development of tissue hypoxia and the activation of the NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing 3) inflammasome leading to the production of inflammatory cytokines have been associated with both comorbidities and may constitute a link between PDT and T2D. This study aimed to determine the expression of HIF-1α and its target genes, namely VEGF-A, Glut1 and ADM, as well as the expression of pro-inflammatory cytokines, IL-1β and IL-18, associated with the NLRP3 inflammasome in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with PDT, T2D and both comorbidities, compared with healthy subjects (controls). After isolation of PBMCs, RNA extraction was performed and then it was converted into cDNA. Finally, mRNA levels were quantified through qRT-PCR. Our results showed a decrease in HIF-1α and VEGF-A mRNA levels in the PDT group and a decrease in HIF-1α mRNA levels in PDT-T2D patients compared to T2D patients; there was also a significant decrease in Glut1 gene expression in PBMCs from PDT-T2D patients, when compared to PDT and T2D cells; additionally, an increase in ADM mRNA levels was detected in the T2D participants, while a significant decrease was observed in PDT-T2D PBMCs when compared to T2D PBMCs. The analysis of pro-inflammatory cytokines allowed to detect an increase in pro-IL-1β expression levels in the T2D group; however, there were no differences in pro-IL-18 mRNA levels in PDT, T2D, PDT-T2D groups compared to the control. The correlation analysis of the investigated parameters showed a strong correlation between the expression levels of HIF-1α and VEGF-A, ADM and pro-IL-1β and a very strong correlation between ADM and pro-IL-1β mRNA levels; a moderate correlation was observed between ADM/pro-IL-1β mRNA levels and HbA1c; and a moderate correlation was determined between HIF-1α and VEGF-A expression levels with the periodontal parameters CAL and PD. Based on these data, we conclude that patients with PDT have a decrease in the expression of both HIF-1α and VEGF-A and, on the other hand, patients with T2D have a higher expression of ADM and pro-IL-1β, which may suggest different mechanisms of action of these molecules in PDT and T2D. In conclusion, the definition of cellular mechanisms associated with PDT and T2D may be important in identifying more effective therapeutic targets for each one of these two pathologies and for PDT-T2D conditions.