Implementation of a Customised Light-Sheet Microscope

Abstract

Light-Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) is an imaging technique that has gained interest due to its ability to image large samples three-dimensionally. The relevance of the LSFM is due to its distinctive feature, the light-sheet, and its architecture, where the illumination path is orthogonal to the detection path. In essence, a plane of light illuminates a section of the sample, which is then captured by the detection unit perpendicular to that plane, therefore performing optical sectioning. This means that only light from the plane in focus is captured, which also minimizes the effects of photobleaching and phototoxicity, as only that section is illuminated.When discussing LSFM, tissue clearing always arises. It is possible to image entire samples, such as mouse organs, with LSFM. However, if they are opaque, the light-sheet can not penetrate the tissue. For this reason, it is necessary to render the samples transparent. Many tissue clearing protocols have been developed in order to achieve minimal light scattering and absorption, although there is no perfect technique that fits all samples. Different tissues, labels, sample sizes, or other specifications may ask for different approaches.In this present work, two tissue clearing protocols were explored - iDISCO+, a solvent-based protocol, and CUBIC, an aqueous-based protocol. The results for mouse brain samples and mouse liver samples were photographically documented to showcase the evolution of the samples as they progress through the steps of clearing. The samples were also labelled and imaged with the Confocal Microscope to confirm if the protocols are compatible with fluorescent labelling.Even though LSFM has gained popularity in the last few years, it may not be available in all research institutes - it would be useful to have a screening tool for cleared and labelled samples at hand. For this reason, in this project, we aimed to assemble the open-source light-sheet microscope LEMOLish, which was created by Julien Colombelli and Sébastien Tosi of the Institute for Research in Biomedicine of Barcelona. To improve the system and increase the openness to the community, Arduino code was developed to control the microscope. Therefore, this thesis describes the assembly of the LEMOLish and the Arduino code in use, as well as documents the three-dimensional images of mouse brain samples obtained with it. The results presented in this thesis underscore the LEMOLish system's strong potential to successfully achieve its primary objective of screening cleared samples.

A Microscopia de Fluorescência em Folha de Luz (Light-Sheet Fluorescence Microscope ou LSFM em inglês) é uma técnica de imagiologia que tem ganho interesse devido à sua capacidade de obter imagens tridimensionais de amostras de grandes dimensões. A relevância da LSFM deve-se à sua caraterística distintiva, a folha de luz, e à sua arquitetura, em que o percurso de iluminação é ortogonal ao percurso de deteção. Essencialmente, um plano de luz ilumina uma secção da amostra, que é depois captada pela unidade de deteção perpendicular a esse plano, realizando assim o seccionamento ótico. Isto significa que apenas é captada a luz do plano em foco, o que também minimiza os efeitos de fotobranqueamento e fototoxicidade, uma vez que apenas essa secção é iluminada.Quando se discute a LSFM, surge sempre a questão da transparentização de tecidos (tissue clearing). É possível obter imagens de amostras inteiras, como órgãos de ratos, com LSFM. No entanto, se estas forem opacas, a folha de luz não consegue penetrar o tecido. Por este motivo, é necessário tornar as amostras transparentes. Foram desenvolvidos vários protocolos de transparentização de tecidos para conseguir uma dispersão e absorção mínimas da luz, embora não exista uma técnica perfeita para todas as amostras. Diferentes tecidos, marcação fluorescente, tamanhos de amostras ou outras especificações podem exigir abordagens diferentes.No presente trabalho, foram explorados dois protocolos de transparentização de tecidos - iDISCO+, um protocolo à base de solvente, e CUBIC, um protocolo à base de água. Os resultados das amostras de cérebro e fígado de rato foram documentados fotograficamente para mostrar a evolução das amostras à medida que progridem nas etapas de transparentização. As amostras foram também marcadas e visualizadas com o microscópio confocal para confirmar se os protocolos são compatíveis com a marcação fluorescente.Embora a LSFM tenha ganho popularidade nos últimos anos, pode não estar disponível em todos os institutos de investigação - seria útil ter uma ferramenta para a avaliação das amostras transparentizadas e marcadas. Por este motivo, neste projeto, procedeu-se à montagem do microscópio de folha de luz open-source LEMOLish, criado por Julien Colombelli e Sébastien Tosi do Instituto de Investigação em Biomedicina de Barcelona. Para melhorar este sistema e aumentar a sua acessibilidade à comunidade, foi desenvolvido código Arduino para o controlo das várias partes do microscópio. Por conseguinte, esta tese descreve a montagem do LEMOLish e o código Arduino em uso, bem como documenta as imagens tridimensionais de amostras de cérebro de rato com ele obtidas. Os resultados apresentados nesta tese sublinham o forte potencial do sistema LEMOLish para atingir com sucesso o seu objetivo principal de avaliar amostras transparentizadas.