Influência da distribuição do peso molecular de copolímeros de bloco catiónicos no seu desempenho como vetores de entrega de material genético para tratamento do cancro

Abstract

Polymers are very attractive materials to use in biomedical applications, namely high-value applications such as gene delivery, due to their structural versatility and specific features, such as ability to self-assemble or to avoid organism immune responses in their presence. Using reversible deactivation radical polymerization (RDRP) techniques, it is possible to prepare tailor-madepolymers with predetermined molecular weight, architecture, functionality, composition, and molecular weight distribution (dispersity), which have direct impact on their therapeutic efficacy.The aim of this work was to evaluate the influence of cationic block copolymers dispersityin their performance as gene delivery vectors for cancer treatment. In the first part of the work, poly (oligo (ethylene oxide) methyl ether) methacrylate-block-poly (2-diisopropylamino) ethyl methacrylate (POEOMA-b-PDPA) with similar molecular weight (Mn ≈ 45000) and distinct dispersity (1.2 < Ꟈ = Mw/Mn < 1.83), were synthesized using RDRP techniques, namely atom transfer radical polymerization (ATRP). The first task involved the synthesis and purification of POEOMA-Br macroinitiators, that were further extended with DPA monomer to give POEOMA b-PDPA block copolymers. The variation of the dispersity was achieved through the variation of the catalytic complex concentration during the DPA polymerization. The block copolymers werecharacterized by size exclusion chromatography (SEC), proton nuclear magnetic resonance (1H RMN) spectroscopy and their pKa values (≈ 6.3) were determined by potentiometric titration. In the second part of the work, the copolymers were complexed with genetic material (sRNA) to give polyplexes and their encapsulation efficiency was evaluated by UV-Vis spectroscopy and agarose gel. The results showed that, in the investigated range, there was no significant influence of thecopolymers dispersity on their sRNA complexation capacity, which ranged between 15% and 40%, in comparable samples and depending on the copolymer concentration. The particle size and zeta potential of the polyplexes obtained with the copolymer that showed the highest sRNA complexation efficiency (POEOMA39-b-PDPA39) were determined by dynamic light scattering (DLS). The results showed that for a copolymer at concentration of 0.25 mg/mL, there was formation of polyplexes with positive charge and average diameter suitable for application in gene therapy for cancer treatment. The polyplexes prepared with at copolymer concentration (0.05 e 0.1 mg/mL) exhibited negative charge, most probably due to the high sRNA encapsulation efficiency (≈ 85%).

Os polímeros têm-se mostrado materiais muito atrativos para aplicações na área da saúde, nomeadamente aplicações de alto valor, como o transporte e entrega de material genético (gene delivery). Isto deve-se à elevada versatilidade das estruturas poliméricas e a características mais específicas, como a capacidade de self-assembly ou de mascarar respostas imunitárias do organismo. Através do uso de técnicas de polimerização radicalar por desativação reversível (RDRP) é possível preparar polímeros com peso molecular, arquitetura, funcionalidade, composição e polidispersividade pré-determinados, permitindo assim o fine tunnig das suas características, que têm impacto na sua eficiência terapêutica.O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da polidispersividade de copolímeros de bloco catiónicos no seu desempenho como transportadores de material genético para o tratamento do cancro. Na primeira parte do trabalho, foram sintetizados diferentes copolímeros de bloco, poli(metacrilato de (oligo (óxido de etileno) metil éter))-bloco-poli(metacrilato de (2-diisopropilamino) etilo) (POEOMA-b-PDPA) com peso molecular semelhante (Mn ≈ 45000) e polidispersividade diferente (1,2 < Đ = Mw/Mn < 1,85), recorrendo a técnicas de RDRP, nomeadamente polimerização radicalar por transferência de átomo (ATRP). A primeira etapa envolveu a síntese e purificação do macroiniciador POEOMA-Br, cujas cadeias foram posteriormente estendidas com DPA para formar o copolímero de bloco POEOMA-b-PDPA. A variação da polidispersividade dos copolímeros foi conseguida através da variação da concentração de catalisador durante a polimerização do DPA. Os copolímeros foram caracterizados por cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC), espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H RMN) e o seu valor de pKa (≈ 6,3) foi determinado por titulação potenciométrica. Na segunda parte do trabalho, os copolímeros preparados foram complexados com material genético (sRNA), formando poliplexos, e a sua capacidade de encapsulação foi avaliada por espectroscopia UV-Vis e em gel de agarose. Os resultados mostraram que, na gama investigada, não houve influência significativa da polidispersividade dos copolímeros na sua capacidade de complexação de sRNA, que se situou entre 15% e 40%, em amostras comparáveis e dependendo da concentração de copolímero. O tamanho de partícula e potencial Zeta dos poliplexos obtidos com o copolímero que mostrou maior eficiência de complexação de sRNA (POEOMA39-b PDPA39) foram determinados por dispersão dinâmica de luz (DLS). Os resultados mostraram que para uma concentração de copolímero de 0,25 mg/mL, houve formação de poliplexos de carga positiva e com tamanho adequado para aplicação em terapia génica para tratamento do cancro. Os poliplexos preparados com baixa concentração de copolímero (0,05 e 0,1 mg/mL) apresentaram carga negativa, potencialmente decorrente da alta eficiência de encapsulação de sRNA (≈ 85%).