Microplastics in rivers and their role in the spread of pathogens and antibiotic resistance

Abstract

A resistência a antibióticos (RA) é um dos problemas de saúde pública mais relevantes atualmente, devido aos elevados níveis de mortalidade e comorbilidades a ela associados. Com a crescente disseminação e evolução da RA em bactérias, é extremamente necessário concentrar esforços no sentido de investigar a origem desta resistência e que pode promover a sua disseminação. Em ambientes aquáticos, que estão entre os principais reservatórios ambientais de RA, entende-se que a ocorrência de vetores como os microplásticos (MPs) pode potenciar a disseminação da RA, através dos ecossistemas e tanto para animais como para humanos. Este estudo teve como objetivo avaliar o papel dos microplásticos na disseminação de bactérias patogénicas e resistentes a antibióticos nos rios. Foi também nosso objetivo determinar a influência do local e do tipo de polímero na plastisfera (comunidade de microrganismos associados aos microplásticos). Para isso, foram realizados dois ensaios no campo em que microplásticos de polipropileno (PP) e polietileno (PE) e partículas de areia foram expostos durante 21 dias em 4 locais (SS1, SS2, SS3 e SS3) do rio Antuã, sob o efeito previsto de diferentes pressões. Para a análise das comunidades bacterianas foram aplicadas abordagens dependentes e independentes de cultivo.Bactérias patogénicas prioritárias cultivadas a partir de biofilmes dos substratos, resistentes a meropenemo e cefotaxima, foram selecionadas e caracterizadas, genotípica e fenotipicamente. Os resultados apontam para uma maior abundância e prevalência de bactérias resistentes em microplásticos, predominantemente em PE, em comparação com partículas de areia e água. No entanto, tanto a abundância como a prevalência dependeram do local e do polímero, e variaram entre ensaios. Entre as bactérias resistentes à cefotaxima incluíram-se Enterobacteriaceae (n = 9), identificadas como Enterobacter (n = 4), Escherichia (n = 1), Citrobacter (n = 3) e Klebsiella (n = 1). Todos os isolados produziram biofilme e três isolados exibiram um fenótipo de multirresistência. Entre estes, dois foram identificados como portadores dos genes blaCTX-M, blaTEM, tetA e intI1. Estes dois isolados, provenientes da areia e do PE, foram capazes de transferir as características de resistência para uma estirpe recetora suscetível.Recorrendo a uma abordagem independente do cultivo, a composição das comunidades nas amostras foi analisada por sequenciação Illumina do gene 16S rRNA e o resistoma, o mobiloma e potenciais agentes patogénicos foram quantificados utilizando um SmartChip Real-Time PCR. A diversidade e a riqueza das comunidades bacterianas dos microplásticos dependeram do local de exposição, com menor diversidade e riqueza semelhante no SS3, e maior diversidade e riqueza no SS4, quando comparadas com a areia e água. Os filos Proteobacteria e Bacteroidota e a família Nitrosomonadaceae observaram-se em maior abundância nos microplásticos. As diferenças entre comunidades foram observadas principalmente ao nível das variantes de sequências de amplicões (ASVs). Foram detetados potenciais agentes patogénicos, nomeadamente Acinetobacter, Flavobacterium e Mycobacterium, nos microplásticos, mas com maior abundância relativa nas amostras de água. Foram detetados genes que conferem resistência a antibióticos (n = 21), metais (n = 1) e desinfetantes (n = 1), genes associados a elementos genéticos móveis (n = 4), genes que codificam bombas de efluxo (n = 1) e genes relacionados com potenciais agentes patogénicos (n = 3). Nas amostras de água foram quantificados mais genes em comparação com os microplásticos, mas sobretudo com a areia. Observou-se um enriquecimento significativo de blaCTX-M e ISCR1 em microplásticos relativamente à água em ambos os locais e de blaVIM apenas em SS3. Entre os microplásticos e a areia, embora a maioria dos genes quantificados tendesse a ser mais abundante nos microplásticos, não foi observado um enriquecimento significativo. Este estudo confirma a presença de bactérias resistentes a antibióticos em microplásticos com potencial patogénico e de disseminação de RA. Além disso, confirma que o tipo de polímero, bem como o local onde os microplásticos são expostos, são relevantes para a composição da comunidade e para o resistoma e mobiloma associados.

Antibiotic resistance (AR) is one of the most relevant public health concerns nowadays due to the high levels of mortality and comorbidities associated with it. With the increasing spread and evolution of AR in bacteria, it is extremely necessary to focus efforts on investigating what can cause this resistance and promote its dissemination. In aquatic environments, which are among the main environmental reservoirs of AR, it is understood that the occurrence of vectors such as microplastics (MPs) may enhance the spread of AR, across ecosystems and both to animals and humans. This study aimed to evaluate the role of microplastics in the dissemination of pathogenic and antibiotic-resistant bacteria in rivers. It was also our aim to determine the influence of location and type of polymer on the plastisphere (community of microorganisms attached to microplastics). To this end, two field assays were carried out in which polypropylene (PP) and polyethylene (PE) microplastics and sand particles were exposed for 21 days at 4 locations (SS1, SS2, SS3 and SS4) in the Antuã River under the predicted effect of different pressures. For the analysis of microbial communities, culture-dependent and culture-independent approaches were applied. Critical priority pathogens cultivated from biofilms of the substrates, resistant to meropenem and cefotaxime, were selected and characterised, genotypically and phenotypically. The results point to a higher abundance and prevalence of resistant bacteria on microplastics, predominantly in PE, compared to sand particles, as well as a higher prevalence then in water. However, both abundance and prevalence depended on location and polymer, and varied between assays. Among the identified cefotaxime-resistant bacteria, Enterobacteriaceae (n = 9) were detected and identified as Enterobacter (n = 4), Escherichia (n = 1), Citrobacter (n = 3) and Klebsiella (n = 1). All isolates exhibited the ability to form biofilm, and three isolates exhibited a multidrug resistance phenotype. Among these, two were identified as carriers of genes blaCTX-M, blaTEM, tetA and intI1. These two isolates were able to pass on their resistance capacity to a susceptible receptor strain. Resorting to a culture-independent approach, the composition of the communities in the samples was analysed by 16S rRNA gene Illumina sequencing and the resistome, mobilome and potential pathogens were quantified using a SmartChip Real-Time PCR. Diversity and richness of the microbial communities within microplastics depended on the exposure location, with lower diversity and similar richness at SS3, and higher diversity and richness at SS4, when compared to sand and water. Proteobacteria and Bacteroidota phyla and the Nitrosomonadaceae family were slightly more abundant in microplastics. Differences between communities were observed mainly at the level of amplicon sequence variants (ASVs). Potential pathogens, namely Acinetobacter, Flavobacterium and Mycobacterium, were detected in microplastics but with higher relative abundance in water samples. Genes conferring resistance to antibiotics (n = 21), metals (n = 1) and disinfectants (n = 1), genes associated to mobile genetic elements (n = 4), genes encoding for efflux pumps (n = 1) and potential pathogens (n = 3) were detected. In water samples were quantified more genes compared to microplastics but mostly to sand. A significant enrichment of blaCTX-M and ISCR1 was observed in microplastics relative to water for both sites and of blaVIM only at SS3. Between microplastics and sand, even though most of the quantified genes tended to be more abundant in microplastics, no significant enrichment was observed. This study confirms the presence of antibiotic-resistant bacteria in microplastics with pathogenic and AR dissemination potential. It further supports that the type of polymer as well as the site where microplastics are exposed are relevant for the community composition and the associated resistome and mobilome.