The role of fibroblasts-derived microvesicles in age-related macular degeneration

Abstract

A degenerescência macular da idade (AMD) é uma doença degenerativa que afeta a área central da retina e é a principal causa de cegueira, a nível mundial, entre os indivíduos mais idosos. As duas formas avançadas da doença, a atrofia geográfica e a AMD neovascular, caracterizam-se pela presença de drusen entre a membrana basal do epitélio pigmentado da retina (RPE) e a membrana de Bruch e pela neovascularização do coróide, respetivamente. A patogénese da doença não é totalmente compreendida, mas acredita-se que a transição epitelial-mesenquimal (EMT) desempenha um papel fundamental na disfunção do RPE e no desenvolvimento da fibrose sub-retiniana na AMD. A EMT pode ser induzida ou regulada por várias vias de sinalização e fatores de crescimento, como o TGF-β, e também por vesículas extracelulares (EVs). Estudos recentes sugerem que fatores relacionados com a EMT podem induzir as células do RPE a secretar exossomas enriquecidos em fatores angiogénicos, contribuindo para a neovascularização coróide (CNV). Contudo, o papel das microvesículas (MVs), outro tipo de EVs, na disfunção do RPE continua a ser largamente elusivo. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito das MVs secretadas por fibroblastos na ativação da EMT nas células do RPE. Para isso, utilizámos uma linha de células do RPE espontânea (células ARPE-19) e o TGF-β1 (10 ng/ml) em diferentes períodos (24, 48, e 72 horas) para induzir a EMT. O efeito do TGF-β1 na indução de EMT das células ARPE-19 foi avaliado através da avaliação dos níveis proteicos de marcadores relacionados com a EMT, bem como da análise da atividade metabólica, da proliferação e da migração das células ARPE-19. As MVs foram isoladas por centrifugação diferencial a partir do meio de cultura das células ARPE-19, tratadas ou não com TGF-β1, e o seu efeito foi investigado através da incubação destas MVs com células do RPE residentes. Os resultados mostram que o TGF-β1 não só aumentou significativamente a capacidade de migração das células ARPE-19 após 12 e 24 horas de tratamento, como também aumentou a atividade metabólica após 24 e 48 horas de estimulação. Além disso, as células ARPE-19 mostraram uma maior capacidade de proliferação após incubação com TGF-β1 durante 48 horas. Foi também observada uma tendência para o aumento dos níveis e alterações na imunorreatividade de marcadores relacionados com a EMT, tais como α-SMA, N-caderina, vimentina, e galectina-1 (Gal-1) e uma diminuição dos níveis de ocludina, especialmente após 48 horas de tratamento com TGF-β1. Além disso, o TGF-β1 aumentou a secreção de MVs a partir de células ARPE-19. Contudo, o tratamento das células ARPE-19 com MVs-TGF-β1 não aumentou a sua capacidade migratória ou de proliferação. Pelo contrário, as MVs secretadas por células ARPE-19 sem estimulação com TGF-β1 aumentaram a sua capacidade de proliferação. Globalmente, os nossos resultados revelaram que as MVs secretadas por células ARPE-19 tratadas com TGF-β1 não contribuem para o processo de EMT. No entanto, as MVs per se tiveram efeitos significativos na capacidade proliferativa e migratória das células ARPE-19.

Age-related macular degeneration (AMD) is a degenerative disease affecting the retina´s central area and is the leading cause of blindness for older adults worldwide. The two advanced forms of the disease, geographic atrophy (GA) and neovascular AMD, are characterized by the presence of drusen between the basement membrane of the retinal pigment epithelium (RPE) and the collagenous zone of Bruch's membrane and by neovascularization of the choroid, respectively. The pathogenesis of the disease is not fully understood. However, it is believed that the epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays a key role in RPE dysfunction and the development of subretinal fibrosis in AMD. EMT can be induced or regulated by various signaling pathways and factors, including TGF-β and also by extracellular vesicles (EVs). Recent evidence suggests EMT-related factors can induce RPE cells to secrete exosomes enriched in angiogenic factors, contributing to choroidal neovascularization (CNV). However, the role of microvesicles (MVs), another type of EVs, in RPE degeneration remains largely elusive. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of MVs secreted by fibroblasts on the activation of EMT in RPE cells. For that, we used a spontaneously arising RPE cell line (ARPE-19 cells) and TGF-β1 (10 ng/ml) at different periods (24, 48, and 72 hours) to induce EMT. The effect of TGF-β1 in the induction of EMT of ARPE-19 cells was evaluated by assessing the protein levels of EMT-related markers, as well as analyzing the metabolic activity, proliferation, and migration of ARPE-19 cells. MVs were isolated by differential centrifugation from the culture media of ARPE-19 cells treated or not with TGF-β1, and their effect was investigated by incubating these MVs with recipient RPE cells. Results showed that TGF-β1 significantly increased the migration ability of ARPE-19 cells after 12 and 24 hours of treatment and enhanced the metabolic activity after 24 and 48 hours of stimulation. Furthermore, ARPE-19 cells showed a higher proliferation capacity after incubation with TGF-β1 for 48 hours. A tendency towards increased levels and changes in the immunoreactivity of EMT-related markers such as α-SMA, N-cadherin, vimentin, and galectin-1 (Gal-1), and a decrease in the levels of occludin, were also observed, especially after 48 hours of treatment with TGF-β1. In addition, TGF-β1 increased the secretion of MVs from ARPE-19 cells. However, treatment of ARPE-19 cells with MVs-TGF-β1 did not enhance their migratory or proliferation ability. On the opposite, MVs secreted by ARPE-19 without TGF-β1 stimulation increased the proliferation capacity of ARPE-19 cells. Overall, our results revealed that MVs secreted by ARPE-19 cells treated with TGF-β1 do not contribute to the EMT process. Nevertheless, MVs per se had significant effects on the proliferation and migration ability of ARPE-19 cells.