Molecular mechanism of horizontal mitochondrial transfer from stromal cells to cancer cells with damaged mitochondrial DNA

Abstract

Despite the significant improvement of the therapies over the last decades, cancer remains a burden throughout the world. The abnormal growth of cells is a highly complex process, which involves the dysfunction or re-programming of several organelles and cellular constituents. Mitochondria, organelles involved in a variety of essential cellular functions, such as ATP production, metabolite synthesis and regulation of the cellular redox state, are important players in tumorigenesis. Mitochondrial transfer, a recently described cell-to-cell communication mechanism, can act as a double-edged sword and influence tumor progression. Recently, our laboratory demonstrated that functional electron transport chain (ETC) is essential for tumor growth. We showed that mtDNA-devoid cancer cells (ρ0 cells) form tumors in mice only after acquiring mtDNA from the host and restored respiration. In this dissertation we therefore investigated why functional respiration is important for tumor development using time-resolved analysis of tumor formation from ρ0 cells. After grafting, ρ0 cells were recovered at individual time points and mtDNA as well as various mitochondrial and bioenergetic parameters were evaluated, using qPCR, western blotting, Seahorse analysis and fluorescence microscopy. Moreover, we studied how mtDNA is transferred between cells in vivo using single cell sorting and confocal microscopy. We have also assessed pharmacological approaches to inhibit several steps in this process. For that purpose, two mouse cancer cell lines were used in this study, i.e. the 4T1 breast cancer cell line, which mimics stage IV of human breast cancer, and the B16 melanoma cell line. In this work we demonstrated that repopulation of ρ0 cells by functional mitochondria in vivo occurs at early time points preceding tumor formation. Within five days post grafting, ρ0 cells acquired low amounts of mtDNA and initiated its replication and transcription. By day 15, proteins essential for mtDNA maintenance were reconstituted to the parental cell levels. The initial ρ0 cells did not show parental levels of ETC subunits nor assembled mitochondrial respiratory complexes and supercomplexes. The reconstitution was accompanied by the normalization of several mitochondrial parameters. While respiration was recovered by mitochondrial transfer prior to tumor appearance, the ATP levels were stable during the entire time course, indicating that the absence of mitochondrial ATP production may not be limiting for tumorigenesis. ATP synthase-deficient cells, prepared by knockout the ATP5 subunit of complex V using the CRIPSR/cas9 system, formed tumors, albeit with a delay. This fact further confirmed the exclusion of mitochondrial ATP generation as the main constraint for tumorigenesis. In contrast, knockout of dihydroorotate dehydrogenase (DHODH), a key respiration-linked enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway, completely blocked tumor development. Indeed, DHODH was non-functional in ρ0 cells, and was reactivated by the recovery of complex III/complex IV respiration by mitochondrial transfer before the ρ0 cell-derived tumors started to appear. DHODH activity was suppressed in ρ0 cells due to the absence of oxidized ubiquinone, the electron acceptor for DHODH. Accordingly, recovery of ubiquinone redox-cycling by the introduction of an alternative oxidase (AOX) into ρ0 cells restored DHODH activity, pyrimidine biosynthesis and re-established tumor growth. Since mtDNA acquisition and mitochondrial ETC reconstitution are important for DHODH activation and, consequently, tumorigenesis, we tested different inhibitors. MitoVES treatment, in vitro, suppressed D-loop transcripts and reduced the expression of ETC subunits. On the other hand, DHODH or AOX inhibitors, were able to suppress tumor growth in vivo. We conclude that mtDNA moves between cells within intact mitochondria and most likely via intercellular bridges referred to as “tunneling nanotubes” (TNTs). Furthermore, ρ0 cells, after mitochondrial acquisition, need to recover respiration in order to initiate tumor formation, a process independent of mitochondrial ATP generation. Instead, DHODH-driven pyrimidine biosynthesis presents a crucial link between respiration and tumorigenesis. This work also establishes potential therapeutic targets, including DHODH, TNT blockage or ETC reconstitution.

O cancro, apesar da evolução das terapias anticancerígenas assistida nas últimas décadas, continua a ser uma problemática em todo o mundo. O crescimento anormal das células é um processo altamente complexo, que envolve a disfunção ou reprogramação de diferentes organelos e outros constituintes celulares. A mitocôndria, organelo envolvido em diversas funções celulares cruciais, tais como produção de ATP, síntese de metabolitos e regulação do estado redox celular, é um elemento fundamental na tumorigénese. A transferência mitocondrial, um mecanismo de comunicação intercelular recentemente descrito, pode apresentar uma dualidade funcional e interferir no processo tumoral. Recentemente, demonstrámos que a cadeia transportadora de eletrões funcional é essencial para o desenvolvimento de tumores. Mostrámos que células cancerígenas desprovidas de ADN mitocondrial (células ρ0) apenas formam tumores em ratinho após adquirirem ADN mitocondrial do hospedeiro e a respiração for restabelecida. Nesta dissertação investigámos a razão pela qual uma respiração funcional é importante, usando uma análise temporal de formação de tumores a partir de células ρ0. Após recolha das células ρ0 em dias específicos, o ADN mitocondrial, bem como outros parâmetros mitocondriais e bioenergéticos, foram avaliados, usando PCR quantitativo em tempo real, western blotting, análise de Seahorse e microscopia de fluorescência. Além disso, decidimos estudar de que forma o ADN mitocondrial é transferido entre células in vivo, usando separação por citometria de célula única e microscopia confocal. Também investigámos diversas abordagens farmacológicas com vista à inibição de diferentes etapas neste processo. Para tal, foram usadas duas linhas de cancro de ratinho, linha celular de cancro da mama 4T1, que mimetiza o estadio IV do cancro da mama humano, e linha celular de melanoma B16. Neste trabalho apresentámos evidências de que a re-população de mitocôndrias funcionais nas células ρ0, in vivo, ocorre numa fase inicial que precede a formação dos tumores. Cinco dias após injeção, as células ρ0 adquirem pequenas quantidades de ADN mitocondrial e iniciam a sua replicação e transcrição. Ao décimo quinto dia, as proteínas essenciais para a manutenção do ADN mitocondrial retomam níveis semelhantes aos das células mãe. Inicialmente as células ρ0 também não expressam níveis normais de subunidades da cadeia respiratória, nem formam os complexos e supercomplexos mitocondriais. A reconstituição destes é acompanhada pela normalização de diversos parâmetros de função mitocondrial. Enquanto a respiração é restaurada pela transferência mitocondrial antes do aparecimento do tumor, os níveis de ATP são constantes durante todo o curso da experiência. Assim, ausência de produção de ATP através da via mitocondrial não é, provavelmente, o fator limitante para a tumorigénese. Células deficitárias em ATP sintase preparadas através do nocaute da subunidade ATP5, usando o sistema CRISPR/cas9, formaram tumores, embora com atraso. Este facto confirmou que a produção de ATP via mitocôndria não é a principal restrição. Em contraste, o nocaute da diidroorotato desidrogenase, uma enzima chave da via de síntese de novo de pirimidinas, bloqueou o desenvolvimento do tumor. De facto, o diidroorotato desidrogenase não estava funcional nas células ρ0 e foi reativado pela recuperação da respiração do complexo III/IV, através da transferência mitocondrial e antes dos tumores serem visivelmente detetados. A atividade da diidroorotato desidrogenase foi suprimida nas células ρ0 devido à ausência de ubiquinona oxidada, o recetor de eletrões desta enzima. Em concordância, o restabelecimento do ciclo redox da ubiquinona, através da introdução de uma oxidase alternativa nas células ρ0, restaurou a atividade da diidroorotato desidrogenase, a biossíntese de pirimidinas e o crescimento do tumor. Uma vez que aquisição de ADN mitocondrial e a reconstituição da cadeia transportadora de eletrões são necessárias para a atividade efetiva da diidroorotato desidrogenase, e consequentemente tumorigénese, testámos diferentes inibidores destes processos. O tratamento com mitoVES, in vitro, suprimiu os transcriptos do D-loop e reduziu a expressão das subunidades da cadeia respiratória. Por outro lado, inibidores da diidroorotato desidrogenase e da oxidase alternativa inibiram o crescimento do tumor in vivo. Em suma, o ADN mitocondrial é transferido entre células dentro da mitocôndria intacta e provavelmente via tunneling nanotubes. Além disso, as células ρ0, após a aquisição de mitocôndria, necessitam de recuperar a respiração para iniciarem a formação dos tumores, sendo que este processo é independente da produção de ATP. Por outro lado, a biossíntese de pirimidinas ligada à diidroorotato desidrogenase apresenta uma conexão essencial entre a respiração e a tumorigénese. Este trabalho estabelece ainda potenciais alvos terapêuticos, incluindo diidroorotato desidrogenase, tunneling nanotubes e a reconstituição da cadeia respiratória de eletrões.