Analysis of Nrf2-target genes in periodontitis and diabetes subpopulations of human peripheral blood mononuclear cells

Abstract

A periodontite (PDT) é uma doença inflamatória crónica, resultante de um biofilme disbiótico subgengival que afeta os ligamentos periodontais e o osso em redor dos dentes, conduzindo à perda dentária. A diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma síndrome metabólica caraterizada por hiperglicemia, sendo considerada um fator de risco para o desenvolvimento de PDT. Têm sido observados biomarcadores de stresse oxidativo no sangue periférico de pacientes com PDT e DM2, porém a sua associação ainda não é clara. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a análise da expressão de genes alvo relacionados ao fator nuclear eritróide 2 (Nrf2, do inglês “nuclear factor erythroid 2-related factor 2”), envolvidos na resposta ao stresse oxidativo, em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês “peripheral blood mononuclear cells”) e subpopulações derivadas destas células, nomeadamente linfócitos CD3+CD8+, de pacientes com PDT, DM2 e PDT-DM2 versus indivíduos controlo. Os nossos resultados evidenciam que pacientes com PDT e aqueles com as duas condições (PDT-DM2) apresentam marcadores clínicos periodontais alterados, enquanto indivíduos com DM2 e PDT-DM2 apresentam níveis aumentados de hemoglobina glicada (HbA1c). As PBMCs foram isoladas em quatro subpopulações celulares, nomeadamente linfócitos CD3+CD4+, linfócitos CD3+CD8+, linfócitos “não CD3+” e monócitos, por FACS (do inglês “fluorescence activated cell sorting”). O mRNA das PBMCs e das suas subpopulações foi isolado para avaliar a expressão génica de diferentes alvos do Nrf2, particularmente SOD1, GCLc, GST e HO1. Os nossos resultados revelaram níveis reduzidos de SOD1, GST e GCLc e uma tendência, embora sem significado estatístico, de diminuição nos níveis de mRNA de HO1 em pacientes com PDT, quando comparados com indivíduos controlo. Além disso, os níveis de mRNA de SOD1 e GCLc estavam diminuídos em doentes com PDT-DM2. Curiosamente, os níveis de mRNA de SOD1 e GST também estavam reduzidos, enquanto os níveis de mRNA de HO1 não sofreram alteração na subpopulação de linfócitos CD3+CD8+ em pacientes com PDT e PDT-DM2. Os nossos resultados também sugeriram um aumento significativo na expressão de HO1 e uma tendência para níveis aumentados de mRNA de GST nas PBMCs de pacientes com PDT-DM2, em comparação com indivíduos com PDT. Em suma, os nossos dados revelam uma diminuição da expressão de genes alvo do Nrf2 em pacientes com PDT associada ou não a DM2, tanto em PBMCs como em linfócitos CD3+CD8+, sugerindo um fator comum subjacente ao dano tecidular causado por PDT. Assim, a relação bidirecional entre a desregulação oxidativa e as características patológicas da PDT parece ser relevante na procura de novos alvos terapêuticos.

Periodontitis (PDT) is a chronic inflammatory disease, resulting of a dysbiotic subgingival biofilm’s that affects both the periodontal ligaments and bone surrounding teeth, leading to consequent tooth loss. Type-2 diabetes mellitus (T2D) is a metabolic syndrome characterized by hyperglycemia, and a well-recognized risk factor for the development of PDT. Oxidative stress biomarkers have been observed in peripheral blood of PDT and T2D patients, however, their association is still not clear. Therefore, the aim of this study was to analyze the expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)-target genes, involved in oxidative stress response, in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and derived subpopulations, including CD3+CD8+ lymphocytes, from PDT, T2D and comorbid PDT-T2D patients versus control individuals. Our results evidence that PDT patients and those with the two conditions exhibit altered periodontal clinical markers, while T2D and T2D-PDT individuals display augmented levels of glycated hemoglobin (HbA1c). PBMCs were isolated in four cellular subpopulations, namely CD3+CD4+ lymphocytes, CD3+CD8+ lymphocytes, non CD3+ lymphocytes and monocytes by fluorescence activated cell sorting (FACS). mRNA was further isolated from both whole PBMCs and its subpopulations in order to evaluate the gene expression of different Nrf2 targets, namely SOD1, GCLc, GST and HO1. Our results reveal reduced levels of SOD1, GST and GCLc and a tendency, although without statistical significance, of decreased mRNA levels of HO1 in PDT patients, when compared to control individuals. Moreover, SOD1 and GCLc mRNA levels were diminished in PDT-T2D. Interestingly, SOD1 and GST mRNA levels were also decreased while HO1 mRNA levels were unaltered in CD3+CD8+ lymphocyte subpopulation derived from PDT and PDT-T2D patients. Our results also suggest a significant increase in HO1 expression and a tendency for increased GST mRNA levels in PBMCs from PDT-T2D patients in comparison to PDT. Altogether, our data reveal decreased expression of Nrf2-target genes in PDT with or without T2D in both PBMCs and CD3+CD8+ lymphocytes, suggesting a common factor underlying PDT-associated tissue damage. Thus, bi-directional relationship between oxidative deregulation and PDT pathological features might be relevant when exploring new therapeutical targets.