Efeitos do Rádio-223 em modelos celulares de cancro da próstata metastático

Abstract

O cancro da próstata é o quinto cancro mais mortal e o segundo mais frequentemente diagnosticado no sexo masculino, a nível mundial. Desde 2006, a incidência de cancro da próstata sofreu um aumento global de 40%, em parte devido ao envelhecimento da população, já que a idade é um dos fatores de risco mais correlacionado com esta esta patologia. A terapia de privação de androgénios é um dos tratamentos standard, particularmente para o cancro da próstata avançado. No entanto, após um certo período, o tumor pode tornar-se resistente a esta terapêutica, progredindo para cancro da próstata resistente à castração. Uma grande percentagem dos doentes neste estádio da doença acaba por desenvolver metástases, sendo as mais frequentes as metástases ósseas, passando a designar-se cancro da próstata metastático resistente à castração. Esta fase mais avançada de cancro da próstata está associada a um prognóstico muito desfavorável, devido à escassez de opções de tratamento. Foi, assim, necessário desenvolver novas estratégias terapêuticas, tais como o uso do radiofármaco dicloreto de rádio-223 (Xofigo®, Bayer Pharma), o primeiro emissor alfa aprovado para uso clínico. O rádio-223 atua como um análogo do cálcio, pelo que, após administração intravenosa, se vai depositar na superfície dos ossos e é particularmente absorvido em zonas de maior renovação óssea, características das metástases ósseas, onde substitui o cálcio e incorpora os complexos de hidroxiapatite. Contudo, os mecanismos moleculares e os alvos envolvidos no modo de ação do rádio-223 ainda não são totalmente conhecidos, o que é apontado como uma limitação na sua aplicabilidade clínica.Assim, o principal objetivo deste projeto consistiu na avaliação dos efeitos radiobiológicos do rádio-223 em modelos celulares de cancro da próstata, com foco nas culturas 3D. Este tipo de culturas permite uma mimetização mais realista do microambiente tumoral in vivo. Para alcançar este objetivo, foi desenvolvido e otimizado um modelo celular 3D homotípico de cancro da próstata, usando a técnica de cultura de sobreposição líquida em placas de baixa aderência específicas para a formação de esferoides. De seguida, os efeitos do radiofármaco, ao nível da proliferação e da sobrevivência celular, foram estudados em duas linhas celulares de cancro da próstata metastático, após exposição de células PC3 e LNCaP, cultivadas em 2D, a diferentes atividades volúmicas (55-7 040 Bq/mL) e diferentes tempos de exposição. Os efeitos da exposição ao rádio-223 foram também avaliados em culturas 3D, mais especificamente em esferoides homotípicos de células PC3, ao nível da estrutura dos esferoides, da viabilidade, da morte e da morfologia celular.De um modo geral, a irradiação das células PC3 e das células LNCaP, em cultura 2D, provocou uma diminuição da proliferação e da sobrevivência celular, acentuando-se com o aumento da atividade volúmica inicial de rádio-223 e com o aumento da duração da exposição a este radiofármaco. Para além disso, as células LNCaP apresentaram uma maior radiossensibilidade ao rádio-223, em comparação com as células PC3, o que poderá estar relacionado com as diferentes origens das duas linhas celulares.O modelo celular 3D de cancro da próstata, otimizado ao longo deste projeto, permitiu a rápida obtenção de esferoides de células PC3 coesos, compactos e reproduzíveis, os quais se mantiveram em cultura sem se desintegrarem por vários dias, possibilitando a realização de ensaios de radiobiologia a longo prazo. Porém, a utilização da mesma metodologia com a linha celular LNCaP não permitiu formar esferoides consistentes, pois as células ficaram dispersas nos poços em pequenos agregados. A exposição dos esferoides de células PC3 ao rádio-223 levou à progressiva desintegração dos esferoides ao longo do tempo e, consequentemente, à diminuição do seu tamanho. A desintegração dos esferoides observou-se, principalmente, na região periférica e foi tanto maior quanto maior a atividade volúmica inicial de rádio-223 adicionada. Verificou-se, também, o decréscimo da viabilidade celular e o aumento da morte celular, especialmente por apoptose, com o aumento da atividade volúmica inicial de rádio-223. Corroborando estes resultados, observou-se um maior número de alterações morfológicas nas células dos esferoides irradiados, principalmente características de morte celular por apoptose.Concluindo, os resultados obtidos mostraram que o rádio-223 teve um efeito citotóxico em ambos os modelos celulares de cancro da próstata (2D e 3D), nomeadamente a diminuição da proliferação, da sobrevivência e da viabilidade celular, associadas ao aumento da morte celular essencialmente por apoptose. Estes resultados reforçam a potencialidade do uso deste radiofármaco no tratamento de doentes em estádio avançado da doença, especialmente com cancro da próstata metastático resistente à castração.

Prostate cancer is the fifth deadliest cancer and the second most frequently diagnosed in males worldwide. Since 2006, the incidence of prostate cancer has increased overall by 40%, partly due to the ageing of the population, as age is one of the risk factors most correlated with this pathology. Androgen deprivation therapy is one of the standard treatments, particularly for advanced prostate cancer. However, after a certain period, the tumor may become resistant to this therapy, progressing to castration-resistant prostate cancer. A large percentage of patients at this stage of the disease develop metastases, the most frequent being bone metastases, reaching the worst stage of the disease, the metastatic castration-resistant prostate cancer. This more advanced stage of prostate cancer is associated with a very unfavorable prognosis due to the lack of treatment options. Therefore, it was necessary to develop new therapeutic strategies, such as the use of the radiopharmaceutical radium-223 dichloride (Xofigo®, Bayer Pharma), the first alpha emitter approved for clinical use. Radium-223 acts as a calcium mimic, with natural deposition on the surface of the bones, particularly in areas of greater bone renewal, characteristic of bone metastases, where it substitutes for calcium in hydroxyapatite complexes. However, the molecular mechanisms and targets involved in the mode of action of radium-223 are not yet fully known, which is pointed out as a limitation in its clinical applicability.Thus, the main goal of this project was to evaluate the radiobiological effects of radium-223 in cellular models of prostate cancer, focusing on 3D cultures. This type of cultures allows a more realistic mimetization of the in vivo tumor microenvironment. To achieve this goal, a homotypic 3D cellular model of prostate cancer was developed and optimized, using the liquid overlay technique on ultra-low attachment plates specific for the formation of spheroids. Then, the radiobiological effects of the radiopharmaceutical, at the level of cell proliferation and survival, were studied in two cell lines of metastatic prostate cancer, after exposure of PC3 and LNCaP cells, cultivated in 2D, to different volumic activities (55-7 040 Bq/mL) and different exposure times. The effects of radium-223 exposure were also evaluated in 3D cultures, more specifically in homotypic PC3 spheroids, at the level of the spheroids structure and morphology as well as regarding to cell viability and types of death.In general, irradiation of PC3 and LNCaP cells in 2D culture induced a decrease in cell proliferation and survival, increasing with increasing initial volumic activity of radium-223 and duration of exposure to this radiopharmaceutical. Furthermore, LNCaP cells showed a higher radiosensitivity to radium-223 compared to PC3 cells, which may be related to the different origins of the two cell lines.The 3D cell model of prostate cancer, optimized throughout this project, allowed the fast production of cohesive, compact, and reproducible PC3 spheroids, which remained in culture without disintegrating for several days, enabling long-term radiobiology assays. However, the use of the same methodology with the LNCaP cell line did not form consistent spheroids, because the cells were dispersed in the wells in small aggregates. Exposure of PC3 spheroids to radium-223 led to their progressive disintegration over time and, consequently, to the decrease in their size. The disintegration of the spheroids was observed mainly in the peripheral region, increasing the greater the initial volumic activity of radium-223. There was also a decrease in cell viability and an increase in cell death, especially by apoptosis, with the increase of the initial volumic activity of radium-223. Corroborating these results, it was observed a higher number of morphological changes in cells from irradiated spheroids, mainly features of cell death by apoptosis.In conclusion, the results showed that radium-223 had a cytotoxic effect in both cell models of prostate cancer (2D and 3D), in particular a decrease in proliferation, survival, and cell viability, associated with increased cell death mainly by apoptosis. These results reinforce the potential use of this radiopharmaceutical in the treatment of patients at an advanced stage of the disease, especially with metastatic castration-resistant prostate cancer.