Role of Mitochondria-Derived Damage-Associated Molecular Patterns associated to extracellular microvesicles in promoting early microglia-mediated pro-inflammatory response in neurodegenerative disorders

Abstract

Disfunção mitocondrial e autofágica vem sido considerada como um dos atores principais na patogénese de doenças neurodegenereativas. Embora os mecanismos de controlo de qualidade mitocondrial sejam essenciais para a manutenção da estrutura e função da mitocôndria, estes podem ser perturbados pela deterioração do eixo mitocondria-lisossoma (via degradação do lisossoma). Outro mecanismo de controlo de stress mitocondrial é a geração de vesículas derivadas da mitocôndria, um processo que aparenta ser complementar à mitofagia que gere a fusão de vesículas enriquecidas em proteínas com o sistema endolisossomal, levando à formação de corpos multivesiculares e à sua libertação no meio extracelular como vesículas extracelulares. As vesículas extracelulares são partículas microscópicas (30-150 nm) que têm conteúdo específico associado a cada célula, sendo essenciais para a comunicação inter-celular envolvida em processos fisiológicos e patológicos. As VDMs são particularmente enriquecidas em padrões moleculares associados a danos mitocondriais, podendo fundir com corpos multivesiculares, ser libertados no meio extracelular como vesículas extracelulares e desencadear uma reacção imunitária. Os DAMPs são moléculas endógenas capazes de interagir com receptores da microglia, activando-os, sendo um produto comum da atividade mitocondrial.Neste trabalho, primeiro pretendemos descrever como a deficiencia do eixo mitocondrial-lisossomal junto com fragmentação mitocondrial poderá induzir a disfunção mitocondrial. Em segundo lugar, investigamos como é que a deterioração mitocondrial-lisossomal pode modular a segregação aumentada de vesículas extracelulares e aumento da carga mitocondrial, nomeadamente o ADN mitocondrial, complementando o papel da mitofagia de remover moléculas mitocondriais.De forma a aprofundar a associação entre a disfunção mitocondrial, secreção de vesículas extracelulares e inflamação, avaliámos como é que mitocôndrias livres, ADN mitocondrial, vesículas extracelulares e ADN isolado de vesículas extracelulares pode ativar a microglia e modular o seu perfil transcripcional. Assim, propusemos expandir o nosso conhecimento de como padrões moleculares associados a danos mitocondriais podem induzir a resposta inflamatória mediada pela microglia. Para isso, induzimos a despolarizaçao mitocondrial e inibimos a acidificação lisossomal em fibroblastos, através da incubação com carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) and chloroquine (CQ), respetivamente. A disfuncao mitocondrial induzida pelos estimulos mencionado foi descrita através da análise de alteraçoes na morfologia mitocondrial, espécies reativas de oxigénio presentes na mitocôndria e a biogénese mitocondrial. De seguida, isolámos vesículas extracelulares de meio de fibrobrastos usando um protocolo de centrifugacao diferencial. Investigámos as alteraçoes nas vesículas extracelulares segregadas (via análise por NTA) e carga, especialmente ADN mitocondrial e os seus niveis de oxidação (através da quantificacao de 8-OHdG). Por fim, incubámos microglia da linha N9 com mitocôndrias livres, mtDNA, EVs, e DNA isolado de amostras EVs obtidos de fibroblastos tratados com diferentes condições. Apos a incubação, analisámos as respostas inflamatorias, medindo os niveis de transcriptases (IL-1β, TNF-α, HMGB1, e Arg1) e ambos NF-kβ citoplasmático e nuclear.Observámos que fibroblastos incubados com FCCP e/ou CQ demonstraram um aumento em fissão mitochondrial, aumento nos níveis de espécies reativas de oxigénio e alterações na transcrição de fatores biogenéticos essencias na mitocôndria, nomeadamente um decréscimo em copias de ADN mitocondrial e uma tendência para um aumento em expressão de PGC-1alfa. Os nossos resultados também demonstraram que a inibição de eixo mitocondrial-lisosomal resultou num aumento da secreção de vesículas extracelulares, que provavelmente se deve ao mecanismo de geração complementar de vesículas derivadas da mitocôndria na ocorrência de disfunção mitocondrial. Também observámos um acréscimo significativo de cópias de ADN mitocondrial dentro de vesículas extracelulares secretadas por fibroblastos com deficiência na degradação lisosomal associada a nível altos de ADN mitocondrial oxidado dentro de vesículas extracelulares. Alterações no perfil transcripcional da microglia para vários fatores inflamatórios (IL-1beta, TNF-alpha, Arg1, e HMGBQ) e ativação NF-kbeta foi também documentada antes do tratamento com diferentes estímulos.Os nossos resultados sugeriram que mitocondrias livres e vesículas extracelulares serão os estímulos pró-inflamatórios mais proeminentes, com amostras obtidas através de fibroblastos tratados com FCCP+CQ geralmente mediando maiores mudanças na transcrição de RNA mensageiro relativo a proteínas associadas a resposta inflamatória.Em suma, os nossos dados realçam como é que a deficiencia no eixo mitocôndria-lisossoma pode impactar o papel das vesículas extracelulares no modular da ativacao da microglia, rev

Mitochondrial and autophagy dysfunction are suggested to play important roles in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Mitochondrial quality control mechanisms are essential for the maintenance of correct mitochondrial structure and function, however, said mechanisms can be disrupted by the impairment of the mitochondrial-lysosomal axis (via lysosomal degradation impairment). Another mitochondrial stress control mechanism is the generation of mitochondria-derived vesicles (MDVs), an apparently complementary mechanism to mitophagy that oversees the fusing of mitochondrial protein-enriched vesicles with the endolysosomal system, leading to the formation of multivesicular bodies (MVB) and subsequent release into the extracellular space as extracellular vesicles (EVs). EVs are nanosized particles (30-150nm) that carry cell-specific cargo and are essential for intercellular communication involved in physiological and pathological processes. MDVs are particularly enriched in mitochondria-associated damage-associated molecular patterns (DAMPs) which can fuse with MVB, be rreleasedinto the extracellular space as EVs and induce an immune response. DAMPs are endogenous molecules capable of interacting with microglia receptors, inducing its activation, and mitochondria are a well-known source of such molecules.In this work, we first aimed to describe how the impairment of the mitochondrial-lysosomal axis paired with mitochondrial fragmentation can induce mitochondrial dysfunction. Secondly, we sought to investigate how mitochondrial-lysosomal impairment might modulate increased EV secretion and mitochondrial cargo loading, namely mitochondrial DNA (mtDNA), further complementing the mitophagy role of removing damaged and/or mitochondrial molecules.To expand the association between mitochondria dysfunction, EV secretion and inflammation, we then evaluated how cell-free mitochondria, mtDNA, EVs and EV-isolated DNA can activate murine microglia and modulate its transcriptional profile. As such, we aimed to expand our understanding of how mtDAMPs can induce a microglia-mediated inflammatory response.For that we first induced a mild mitochondrial depolarization and inhibited lysosomal acidification in fibroblasts, via incubation with carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) and chloroquine (CQ), respectively. Mitochondrial dysfunction induced by the referred stimuli was described by analysing alterations in mitochondrial morphology, mitochondrial reactive oxygen species (ROS) levels and mitochondrial biogenesis. Then, we isolated EVs from fibroblast’s conditioned media using a differential centrifugation protocol. We investigated alterations in EV secretion (via NTA analysis) and cargo loading, specifically mtDNA and its oxidation levels (via 8-OHdG quantification). Finally, we incubated N9 microglia with cell-free mitochondria, mtDNA, EVs, and EV-isolated DNA samples obtained from fibroblasts treated with our different conditions. After incubation, we analysed the inflammatory responses by measuring the levels of inflammatory transcripts (IL-1β, TNF-α, HMGB1, and Arg1) and both NF-kβ cytosolic and nuclear localization. We observed that fibroblasts treated with FCCP and/or CQ displayed an increase in mitochondrial fission, increase levels of reactive oxygen species and alterations in the transcription of essential mitochondrial biogenesis factors, namely a decrease in mitochondrial DNA copies and a tendency for increased expression of PGC-1α. Our results also demonstrated that the inhibition of the mitochondrial-lysosomal axis resulted in an increase of EV secretion, which is likely owed to the complementary MDV generation mechanism in the event of mitochondrial dysfunction. We also observed a dramatic increase in mtDNA copies within EVs secreted by fibroblasts with impaired lysosomal degradation, associated to a higher level of oxidized mtDNA within EVs. Alterations in microglia transcriptional profile for several inflammatory factors (IL-1β, TNF-α, Arg1, and HMGB1) and NF-kβ activation was documented upon treatment with different stimuli. Our results suggest that cell-free mitochondria and EVs as the most prominent pro-inflammatory stimuli, with samples obtained from FCCP+CQ-treated fibroblasts generally mediating the most significant mRNA transcriptional fold changes.Overall, our data highlighted how mitochondrial-lysosomal axis impairment may impact EVs role in modulating microglial activation, further shedding new light on the association between mitochondria dysfunction, EV secretion and microglia-mediated inflammation.