Nose-to-brain delivery of lacosamide, levetiracetam and zonisamide and the impact of BCRP efflux: an in vitro/in vivo approach.

Abstract

Epilepsy has a major negative impact on the quality of life of the patients and their families. With an increasing incidence, mortality and morbidity, epilepsy dictates the need for developing new safe and effective therapeutic strategies namely due to the significant percentage of patients who do not respond to the current marketed antiepileptic drugs (AEDs). The blood-brain barrier (BBB) and the efflux transporters therein expressed, including the Breast Cancer Resistance Protein (BCRP), are well-known barriers that must be overcome when an AED is administered by classic systemic routes. Furthermore, the overexpression of efflux transporters has already demonstrated to contribute to the development of pharmacoresistant epilepsy. The current scientific knowledge regarding BCRP interactions with AEDs remains scarce even though this information is extremely important to predict AEDs distribution into the central nervous system (CNS). Ideally, the administration of AEDs through alternative routes that would allow the direct access of the drug to the brain would be desirable. In this context, the present PhD thesis was planned to investigate the potential of the intranasal (IN) route to directly deliver three AEDs of new generation into the CNS. Through neural and olfactory epithelial pathways, their direct nose-to-brain delivery is expected to occur, circumventing the BBB and efflux transporters. To attain this main objective, comparative pharmacokinetic studies were carried out for lacosamide, levetiracetam and zonisamide after their administration through IN, intravenous (IV) and oral routes to male CD-1 mice. Firstly, a high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detection (DAD) method was developed and validated to accurately quantify the AEDs in mouse plasma, brain, lung and kidney tissues collected from the in vivo pharmacokinetic studies. Furthermore, the interaction of the AEDs with the BCRP was assessed in vitro resorting to accumulation and bidirectional transport cell models. Initially, the HPLC-DAD technique was developed and optimized in human plasma to reduce the number of animals required for method development and validation in mouse matrices. It consisted of a gradient elution, mainly made of water, carried on a reversed-phase C18 HPLC column and setting the wavelength at 220 and 239 nm to simultaneously detect the three AEDs and the internal standard (IS). The HPLC-DAD analysis was preceded by a double liquid-liquid extraction (LLE) with ethyl acetate to reproductively extract and concentrate lacosamide, levetiracetam and zonisamide. This technique was validated in accordance with the international guidelines and has been used in routine therapeutic drug monitoring. Minor adjustments were introduced to quantify the AEDs in mice samples. In vitro cell-based models were used to identify BCRP inhibitors and/or substrates. Intracellular accumulation assays used Madin-Darby canine kidney (MDCK-II) cells overexpressing BCRP (MDCK-BCRP) and identified lacosamide and zonisamide as BCRP inhibitors. However, lacosamide demonstrated to be more potent, inhibiting the efflux transporter at therapeutic levels while zonisamide required concentrations considerably superior to those of its therapeutic window. On the other hand, the bidirectional permeability studies carried on MDCK-II and MDCK-BCRP demonstrated that zonisamide is a BCRP substrate. In addition, permeation through nasal mucosa was predicted in vitro through the Human nasal septum cell line (RPMI-2650), demonstrating to increase as the AED lipophilicity enhanced. The in vivo pharmacokinetic profiles achieved for the three AEDs evidenced that all of them markedly attained the brain through nose-to-brain direct transport, even systemic pathways were also evident. Levetiracetam was the one with the highest values of drug targeting efficiency (DTE) and direct transport percentage (DTP) to the brain, which were 182.35 % and 46.38 %, respectively. In addition, it was also demonstrated that the apparent permeability through RPMI-2650 cells was correlated with in vivo brain/plasma ratios but not with DTE or DTP. Lastly, the co-administration of zonisamide (through IN or IV routes) with elacridar, a BCRP inhibitor, demonstrated that the brain concentrations increased after IV injection but remained almost unchanged after IN instillation. These results corroborate that zonisamide is a BCRP substrate and suggest that IN route is probable to reduce the effect of BCRP on drugs transport into the CNS. Taking into account the herein obtained data, IN administration revealed to be a promising strategy to directly deliver AEDs into the brain and avoid the influence of BCRP at the BBB. In a broader application scope, it is hence expected to become a great opportunity for the treatment of refractory epilepsy, reducing also the inter- and intra-individual variability associated to hepatic metabolism and drug-drug interactions (DDI) that are often observed with conventional administration routes.

A epilepsia tem um elevado impacto negativo na qualidade de vida dos doentes e dos seus familiares. Com uma incidência, mortalidade e morbilidade crescentes, a epilepsia impõe a necessidade de descobrir novas estratégias terapêuticas seguras e eficazes, particularmente quando considerada a percentagem significativa de doentes que não responde aos fármacos antiepiléticos (AEDs) atualmente disponíveis na prática clínica. A barreira hematoencefálica (BBB) e os transportadores de efluxo aí expressos, incluindo a Breast Cancer Resistance Protein (BCRP), são barreiras bem conhecidas que têm de ser superadas quando um AED é administrado pelas vias sistémicas clássicas. Além disso, a sobrexpressão de transportadores de efluxo já demonstrou contribuir para o desenvolvimento de epilepsia farmacorresistente. O conhecimento científico sobre a interação da BCRP com AEDs permanece atualmente escasso, apesar da sua relevância na distribuição de AEDs para o sistema nervoso central (CNS). Desta forma, a administração de AEDs por vias alternativas que permitissem o acesso direto do fármaco ao cérebro seria desejável e ideal. Neste contexto, a presente tese de Doutoramento foi elaborada para investigar o potencial da via intranasal (IN) para permitir o acesso direto de três AEDs de nova geração ao cérebro. Através das vias neuronal e olfativa, espera-se que ocorra a passagem direta da cavidade nasal para o cérebro, contornando a BBB e os transportadores de efluxo aí expressos. Para atingir este objetivo, estudos farmacocinéticos foram realizados para a lacosamida, levetiracetam e zonisamida, após administração por via IN, intravenosa (IV) e oral a murganhos CD-1 machos. Primeiramente, desenvolveu-se e validou-se um método de cromatografia líquida de elevada eficiência com deteção de díodos para quantificar com precisão e exatidão os AEDs em plasma, cérebro, pulmão e rim de murganho, obtidos dos estudos in vivo realizados. Para além disso, a interação dos AEDs com a BCRP foi avaliada in vitro com recurso a modelos celulares de acumulação e de transporte bidirecional. Inicialmente, a técnica bioanalítica foi desenvolvida e otimizada em plasma humano para reduzir o número de animais necessário para o desenvolvimento do método e validação em matrizes de murganho. Um único método cromatográfico permitiu a separação dos três AEDs e do padrão interno (IS) numa coluna de HPLC de fase reversa (C18), com recurso a eluição por gradiente e fase móvel constituída maioritariamente por água, com deteção a 220 e 239 nm. A bioanálise foi precedida por uma dupla extração líquido-líquido (LLE), com acetato de etilo, para extrair e concentrar reprodutivelmente a lacosamida, o levetiracetam e a zonisamida. Esta técnica foi validada de acordo com as guidelines internacionais e tem sido utilizada na monitorização dos fármacos referidos. Alguns pequenos ajustes foram introduzidos para quantificar os AEDs em amostras de murganho. Modelos celulares in vitro foram usados para identificar inibidores e/ou substratos da BCRP, recorrendo às linhas celulares de Madin-Darby de rim de cão (MDCK-II) e que sobrexpressam BCRP (MDCK-BCRP). Os ensaios de acumulação permitiram identificar a lacosamida e a zonisamida como inibidores da BCRP. No entanto, a lacosamida demonstrou ser mais potente, inibindo o transportador de efluxo em níveis terapêuticos, enquanto a zonisamida exigiu concentrações consideravelmente superiores à sua margem terapêutica. Por outro lado, os estudos de permeabilidade bidirecional realizados em MDCK-II e MDCK-BCRP revelaram a zonisamida como substrato da BCRP. Além disso, a permeabilidade através da mucosa nasal foi predita in vitro através de células RPMI-2650, demonstrando ser tanto maior quanto maior a lipofilia do AED. Os perfis farmacocinéticos obtidos in vivo evidenciaram o transporte direto dos AEDs ao cérebro, assim como também revelaram que a via sistémica está presente. O levetiracetam foi o AED com maiores valores drug targeting efficiency (DTE) e da percentagem de fármaco diretamente transportado (DTP) para o cérebro (182,35 % e 46,38 %, respetivamente). Além disso, também foi demonstrado que a permeabilidade aparente através das células RPMI-2650 se correlaciona com os rácios cérebro/plasma observados in vivo, mas não com o DTE ou o DTP. Por último, a coadministração de zonisamida (IN ou IV) com elacridar, um inibidor da BCRP, demonstrou que as concentrações cerebrais aumentaram após a injeção IV, mas permaneceram quase inalteradas após a instilação IN. Os resultados identificaram que a zonisamida é substrato BCRP e sugerem que o efeito da BCRP no transporte de fármacos para o SNC pode ser reduzido pela administração IN. Considerando os resultados obtidos durante a presente tese de Doutoramento, a administração IN revelou-se uma estratégia promissora para permitir o acesso direto da lacosamide, levetiracetam e zonisamide ao cérebro e evitar a influência da BCRP na BBB. Assim, espera-se que a via IN represente uma oportunidade não só para o tratamento da epilepsia refratária, mas também para reduzir a variabilidade inter e intra-individual associada ao metabolismo hepático e às interações farmacológicas, frequentemente observadas pelas vias de administração convencionais.