Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/99519
Title: Atividade anti-Leishmania de derivados semissintéticos dos triterpenóides betulina e ácido betulínico
Authors: Varandas, Raquel Rosa
Orientador: Sousa, Maria do Céu Rodrigues de
Conceição, Isabel Luci Pisa Mata da
Issue Date: 2012
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: A leishmaniose é uma doença parasitária causada pelos protozoários do género Leishmania. Esta doença é endémica em 98 países, afetando mais de 12 milhões de pessoas e ameaçando 350 milhões em todo o mundo. Nos últimos anos tem ocorrido uma emergência de leishmaniose em países desenvolvidos devido à coinfeção com VIH. Existem dois ciclos epidemiológicos principais, o zoonótico em que os animais atuam como reservatórios e o antroponótico em que o homem é a única fonte de infeção para o vetor. As espécies de Leishmania durante o ciclo de vida apresentam duas formas principais, morfologicamente distintas: a forma promastigota no inseto vetor e amastigota no sistema mononuclear fagocitário do hospedeiro mamífero. Dependendo da espécie infetante, da resposta imune do hospedeiro e da interação entre o parasita e o hospedeiro, a manifestação da doença pode apresentar-se com três formas clínicas: leishmaniose visceral, cutânea e mucocutânea. Na Europa ocorrem dois ciclos de transmissão, a leishmaniose visceral e cutânea zoonótica causada por L. infantum e a leishmaniose cutânea antroponótica causada por L. tropica. A terapêutica é essencial no controlo desta infeção, especialmente na leishmaniose visceral em que a ausência de tratamento leva à morte. Os fármacos atualmente existentes são os antimoniais pentavalentes, a anfotericina B, a pentamidina e a miltefosina, entre outros. No entanto, todos estes medicamentos possuem limitações devido a sérios efeitos secundários, elevada toxicidade, desenvolvimento de resistência, longa duração de tratamento e elevados custos. É, assim, urgente a procura e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anti-Leishmania de forma a promover alternativas terapêuticas para a leishmaniose. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a atividade anti-Leishmania de 16 derivados semissintéticos da betulina (BT01-BT09) e do ácido betulínico (AB10-AB16). Esta atividade foi avaliada pela viabilidade celular recorrendo ao teste do MTT. Todos os derivados, à exceção de AB12, apresentaram atividade anti- Leishmania. No entanto, apenas se obteve valores de inibição a 50% (CI50) para o derivado da betulina BT06 (50,8 μM) e o derivado do ácido betulínico AB13 (25,8 μM). Para os derivados mais ativos, BT06 e AB13, avaliou-se a natureza das combinações com a miltefosina. Através da análise isobolográfica foi possível verificar que as associações foram sinergísticas, sendo a combinação AB13 e miltefosina a mais eficaz. As vantagens da terapêutica combinada incluem o aumento da eficácia das drogas, diminuição da dosagem, diminuição da toxicidade e um atraso ou prevenção do aparecimento de resistência ao fármaco. Neste sentido, os derivados BT06 e AB13 representam moléculas promissoras a aplicar na terapêutica combinada com a miltefosina. Com o objetivo de elucidar mecanismos responsáveis pela atividade biológica dos derivados BT06 e AB13 foram realizados estudos morfológicos, avaliação da morte celular por apoptose/necrose e avaliação do ciclo celular. O estudo morfológico foi efetuado por microscopia ótica de contraste de fases e após coloração de Giemsa. Nas promastigotas submetidas ao tratamento por BT06 não se observaram efeitos significativos. No entanto, as promastigotas expostas ao AB13 sofreram alterações morfológicas significativas em relação ao controlo, nomeadamente perda da forma fusiforme, tornando-se mais pequenas e redondas, e perda de mobilidade. A morte celular por apoptose/necrose foi avaliada por citometria de fluxo, recorrendo à marcação com Anexina-V/IP, e pelo estudo da integridade do ADN. As células tratadas com os derivados BT06 e AB13 não apresentaram morte significativa por apoptose/necrose. A distribuição das promastigotas pelo ciclo celular foi avaliada por citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídio. Ambos os derivados promoveram a retenção das promastigotas de L. infantum na fase G0/G1 do ciclo celular, sugerindo uma paragem do ciclo nesta fase. A inibição da proliferação celular parece representar um dos principais mecanismos de ação dos derivados da betulina e do ácido betulínico. Tendo em consideração os novos alvos terapêuticos referenciados em Leishmania, a atividade antitumoral dos derivados BT06 e AB13, previamente observada em células cancerígenas, e os resultados obtidos no presente trabalho, sugerese que as cinases dependentes de ciclinas e as topoisomerases de ADN possam representar potenciais alvos moleculares dos derivados BT06 e AB13. Adicionalmente, os derivados BT06 e AB13 não induziram morte em linhas celulares de macrófagos e portanto não apresentarão riscos de toxicidade para o hospedeiro. Em conclusão, este trabalho permitiu identificar o derivado da betulina BT06 e o derivado do ácido betulínico AB13 como moléculas ativas em Leishmania infantum. O derivado AB13 foi o mais eficaz, representando uma molécula promissora a aplicar no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas da leishmaniose.
Leishmaniasis is a parasitic disease caused by protozoans of the Leishmania genus. This disease is endemic in 98 countries, affecting over 12 million people and threatening 350 million worldwide. In recent years there has been an emergence of leishmaniasis in developed countries due to coinfection in individuals with HIV. There are two main epidemiological cycles, the zoonotic where animals act as reservoirs and anthroponotic where man is the only source of infection for the vector. Leishmania species, during the cell cycle, exhibit two main forms, morphologically distinct: promastigote in the insect vector and amastigote in the mononuclear phagocyte system of the mammalian host. Depending on the infective species, the host immune response and the interaction between the parasite and host, the disease can be manifested in three clinical forms: visceral, cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. In Europe there are two transmission cycles, zoonotic visceral and cutaneous leishmaniasis caused by L. infantum and anthroponotic cutaneous leishmaniasis caused by L. tropica. The therapy is essential for infection control, especially for visceral leishmaniasis where the absence of treatment leads to death. The drugs currently available are the pentavalent antimonials, amphotericin B, pentamidine and miltefosine, among others. However, all these drugs have limitations due to serious side effects, high toxicity, development of resistance, long treatment duration and high cost. It’s then crucial to find and develop new molecules with anti-Leishmania activity to promote potential treatments for leishmaniasis. Thus, the purpose of this study was to evaluate the anti-Leishmania activity of 16 semisynthetic derivatives of betulin (BT01 to BT09) and betulinic acid (AB10 to AB16). This activity was assessed by cell viability using the MTT test. All derivatives, except AB12, showed anti-Leishmania activity. However, only for the betulin derivative BT06 (50.8 μM) and AB13 derivative of betulinic acid (25.8 μM) was possible to obtain 50% inhibition (IC50) values. For the most active derivatives, BT06 and AB13, an evaluation of the combination potential with miltefosine was followed. Through the isobologram was possible to verify that all combinations were synergistic, being the combination AB13 and miltefosine the most effective. The benefits of combination therapy include increase in drug efficacy, reduction of dosage, decrease of toxicity and a delay or prevention of drug resistance. Therefore, the derivative BT06 and AB13 seem to be promising molecules for the combination therapy of leishmaniasis, namely with miltefosine. Morphological studies, evaluation of cell death by apoptosis/necrosis and evaluation of the cell cycle were also performed to clarify the mechanisms responsible for the biological activity of the BT06 and AB13 derivatives. The morphological study was executed by phase contrast optical microscopy and after Giemsa stain. There were no significant changes in promastigotes submitted to BT06 treatment. However, promastigotes exposed to AB13 showed significant morphological changes comparing with the control, namely loss of the fusiform shape become smaller and rounder, and loss of mobility. Cell death by apoptosis/necrosis was evaluated by flow cytometry, through Annexin-V/PI labelling and DNA integrity. Cells treated with BT06 and AB13 derivatives didn’t show significant death by apoptosis/necrosis. The distribution of promastigotes in the cell cycle was assessed by flow cytometry after propidium iodide staining. Both derivatives promoted the retention of L. infantum promastigotes in G0/G1 phase, suggesting an arrest of the cycle at this stage. So, the cell proliferation inhibition seems to be the main mechanism of biological activity. Considering the potential therapeutic targets in Leishmania, the previously antitumoral activity of AB13 and BT06 derivatives and the obtained results in this study, we suggested that DNA topoisomerases and cyclin dependent kinases seems to be potential targets of BT06 and AB13 derivatives. Moreover, these derivatives didn’t induce death in macrophage cell lines and therefore don’t present risk of toxicity for the host. In conclusion, this study identified the betulin derivative BT06 and the betulinic acid derivative AB13 as active molecules in Leishmania infantum. The derivative AB13 was the most effective, representing a promising molecule to the development of new alternative therapies for leishmaniasis.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: https://hdl.handle.net/10316/99519
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat
Raquel Varandas.pdf3.52 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

118
checked on Mar 26, 2024

Download(s)

20
checked on Mar 26, 2024

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.