Alergénios cutâneos: moléculas com uma aplicação possível na doença de Alzheimer

Abstract

A doença de Alzheimer (DA), é uma doença neurodegenerativa do sistema nervoso central (SNC) e a causa mais comum de demência. É caracterizada por um processo neurodegenerativo, com morte neuronal em regiões do cérebro responsáveis pelas funções cognitiva e motora. Neuropatologicamente, a DA caracteriza-se pela acumulação do peptídeo beta-amiloide (Aβ), que se acumula em placas senis formando depósitos extracelulares e pela presença anormal de depósitos proteicos no citoplasma dos neurónios, compostos pela proteína tau hiperfosforilada. Associado ao processo neurodegenerativo, ocorre também stress oxidativo e neuroinflamação. Apesar dos avanços em termos fisiopatológicos, ainda não estão disponíveis terapêuticas modificadoras para a DA, com capacidade curativa ou preventiva, existindo apenas tratamento sintomático. Desta forma, os alergénios cutâneos, moléculas eletrofílicas que reagem com resíduos de cisteína, têm capacidade de ativar a via de sinalização Keap1/Nrf2, com papel fundamental na redução do stress oxidativo e da neuroinflamação presentes nos doentes com Alzheimer. Assim, o principal objetivo desta dissertação foi avaliar a capacidade de um alergénio da pele selecionado, prevenir ou reverter a neurodegeneração e neuroinflamação em modelos celulares e animais da DA, através da ativação do fator de transcrição Nrf2. Primeiramente, o alergénio cutâneo foi testado in vitro, nas linhas celulares neuronais de murganho Wild type (N2a-wt) ou com sobrexpressão de APP humana com a mutação swedish (N2a-APPswe), e nas células da microglia de murganho BV-2, expostas a LPS (lipopolissacarídeo). No estudo in vivo o alergénio cutâneo foi administrado por via intranasal (50 mg/kg) durante um mês a murganhos transgénicos APPswe/PSEN1dE9, com cinco meses de idade, que apresentam alguns hallmarks da DA, como a formação de formas insolúveis de Aβ, défices cognitivos e neuroinflamação, aos 6 meses. No final do período de administração, foram realizados testes comportamentais e a análise neuroquímica dos marcadores da DA, no cérebro e plasma dos animais. Para a avaliação do potencial antioxidante, determinou-se in vitro a expressão dos genes dependentes de Nrf2 (Hmox1, Nqo1, Sod1 e Trx1) por RT-PCR e os níveis das proteínas HMOX1, Nrf2, AKT, GSK3β por Western Blotting (WB). Para testar a capacidade anti-inflamatória, avaliou-se a produção de NO pelo reagente de Griess, a expressão de genes pró-inflamatórios (Nos2, IL-1β, Tnf-α e Cox2) por RT-PCR e das respetivas proteínas, iNOS e IL-1β por WB. Foram igualmente testadas por WB, no cérebro e no plasma dos animais, as proteínas APP, BACE1, o fragmento sAPPβsw, HMOX1, IL-1β, iNOS e COX-2. Para a avaliação da função cognitiva in vivo foram realizados os testes Open-Field, Fear Conditioning e Hot Plate. Os resultados demonstraram o potencial do alergénio cutâneo na reversão da neurodegeneração, pelo aumento do gene antioxidante Hmox1, aumento dos níveis das proteínas Nrf2 e HMOX1 e ainda pela diminuição dos níveis da proteína GSK3β, nas células N2a-APPswe, e como anti-inflamatório, pela diminuição da produção de NO, da expressão dos genes Nos2 e IL-1β e das respetivas proteínas, nas células BV-2 expostas a LPS. Para além disto, a tratamento com o alergénio também aumentou a expressão proteica da APP, HMOX1 e P-p44/42, nos cérebros dos murganhos transgénicos APP/PS1, apesar de ainda não se terem observado défices cognitivos nos testes de comportamento realizados. De forma geral, este trabalho salienta o potencial do alergénio da pele estudado, como neuroprotetor e anti-inflamatório, como comprovado pelos resultados nos modelos in vitro e in vivo, que mimetizam os hallmarks da DA.

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS) and the most common cause of dementia. It’s characterized by a neurodegenerative process, with neuronal death in regions of the brain responsible for cognitive and motor functions. Neuropathologically, AD is characterized by the accumulation of beta-amyloid peptide (Aβ), which accumulates in senile plaques forming extracellular deposits and by the abnormal presence of protein deposits in the cytoplasm of neurons, composed by hyperphosphorylated tau protein. Associated with the neurodegenerative process, oxidative stress and neuroinflammation also occur.Despite of the advances in pathophysiology, there are still no curative or preventive therapies available for AD, existing only symptomatic treatment. Thus, skin allergens, electrophilic molecules that react with cysteine residues, are able to activate the Keap1/Nrf2 signaling pathway, with a key role in reducing oxidative stress and neuroinflammation in Alzheimer's patients. Therefore, the main objective of this dissertation was to evaluate the potential of a selected skin allergen, to prevent or reverse neurodegeneration and neuroinflammation in cellular and animal models of AD, through the activation of the transcription factor Nrf2. First, the skin allergen, was tested in vitro, in two mouse neuronal cell lines, Wild type (N2a-wt) or cells with overexpressing human APP with Swedish mutation (N2a-APPswe), and in a mouse microglia BV-2 cells exposed to lipopolysaccharide (LPS). In the in vivo study, the skin allergen was administered intranasally (50 mg/kg) for one month in APPswe/PSEN1dE9 transgenic mice, at five months of age, which exhibit some hallmarks of AD, such as the formation of insoluble forms of Aβ, cognitive deficits and neuroinflammation, at 6 months. At the end of the administration period, behavioral tests and neurochemical analysis of AD markers were performed in the brain and plasma of the animals. To evaluate in vitro antioxidant potential, the expression of Nrf2 dependent genes (Hmox1, Nqo1, Sod1 and Trx1) were determined by RT-PCR and the levels of HMOX1, Nrf2, AKT and GSK3β proteins by Western Blotting (WB). To test the anti-inflammatory potential, the production of NO was evaluated by Griess reagent, the expression of pro-inflammatory genes (Nos2, IL-1β, Tnf-α and Cox2) by RT-PCR and the respective proteins, iNOS and IL-1β, by WB. APP, BACE1, the sAPPβsw fragment, HMOX1, IL-1β, iNOS and COX-2 proteins were also tested by WB in the brain and plasma of the animals. To analyze the cognitive function in vivo, the Open-Field, the Fear Conditioning, and the Hot Plate tests were performed. The results demonstrated the potential of the skin allergen in reversing neurodegeneration by increasing the antioxidant gene Hmox1, increasing the levels of Nrf2 and HMOX1 proteins and also by decreasing the levels of GSK3β protein in N2a-APPswe cells, as well as anti-inflammatory potential by reduction in NO production, decreasing the expression of Nos2 and IL-1β genes and their respective proteins in LPS exposed BV-2 cells. Furthermore, treatment with the allergen also increased the protein expression of APP, HMOX1 and P-p44/42, in the brains of APP/PS1 transgenic mice, although cognitive deficits were not yet observed in the behavioral tests performed. Overall, this work highlights the potential of the studied skin allergen as neuroprotective and anti-inflammatory agent, as demonstrated in in vitro and in vivo models results, that mimic AD hallmarks.