Retinol-binding protein 3: a potential tool for gene therapy in retinal degeneration

Abstract

As patologias da retina caracterizadas pela disfunção dos fotorrecetores podem culminar em perda de visão irreversível. Além disso, contribuem significativamente para o decréscimo da qualidade de vida dos portadores e ainda não possuem tratamentos eficazes. Contudo, a terapia génica é uma abordagem terapêutica promissora que tem sido muito estudada nos últimos anos e que apresenta grande potencial na área da oftalmologia. A investigação do nosso grupo foca-se no desenvolvimento de vetores não virais para patologias da retina e otimização da sua eficiência de transfeção. No entanto, a dificuldade em direcionar estes vetores especificamente para os fotorrecetores é ainda um dos principais obstáculos para uma abordagem de terapia génica com sucesso. Tendo em conta esse obstáculo, neste trabalho investigámos a proteína de ligação ao retinol 3 (RBP3) que interage com os fotorrecetores. Esta proteína tem um papel importante na visão sendo essencial para o normal funcionamento do ciclo visual. A sua função principal é facilitar e acelerar a difusão de retinoides na matriz extracelular entre os fotorrecetores e o epitélio pigmentar da retina e prevenir os efeitos citotóxicos da sua acumulação.Um dos objetivos deste trabalho foi o estudar as interações entre a RBP3 e os fotorrecetores dado que se desconhece os seus ligandos na membrana destas células. Para tal, primeiro construímos os plasmídeos que codificam para a RBP3 e que foram usados ao longo de todo o trabalho. Além disso, verificámos in vitro que as células transfetadas com estes plasmídeos foram capazes de expressar e secretar esta proteína. Em seguida, avaliámos a interação entre os fotorrecetores e a RBP3 através da sua deteção em extratos proteicos de uma linha celular de fotorrecetores incubada num meio com a proteína RBP3. Os nossos resultados demonstraram a ligação da RBP3 a estas células, apoiando a hipótese, já apresentada por outros autores, de que existe uma ligação especifica entre estas. Outro foco deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico do aumento da expressão de RBP3 em modelos animais de degeneração da retina. Para tal, primeiro caracterizámos a expressão desta proteína em murganhos rd16, um modelo animal de amaurose congénita de Leber. Com estes resultados demonstrámos que os fotorrecetores destes animais não expressam RBP3. Este defeito surgiu numa fase muito precoce da doença nestes animais indicando que poderá contribuir para acelerar a degeneração da retina. Por fim, estudámos o potencial terapêutico da administração subretiniana do gene Rbp3 em animais rd16 recém-nascidos. Observámos uma diminuição da degeneração da retina nos olhos injetados comparativamente aos não injetados. Contudo, são necessários mais estudos para confirmar se estes resultados podem ser atribuídos à terapia génica com Rbp3. No seu conjunto estes resultados sugerem que a RBP3 é uma potencial candidata para direcionar vetores não virais para os fotorrecetores. Mostrámos ainda que, dada a sua ausência na fase inicial da degeneração da retina em murganhos rd16, esta proteína pode ser um alvo terapêutico interessante para a terapia génica. Contudo, são necessários mais estudos para avaliar estas possíveis aplicações.

Photoreceptor dysfunction underlies debilitating retinal pathologies that lead to irreversible vision loss. The lack of effective treatments supports gene therapy as a promising therapeutic solution, that in recent years has been shown a great potential in the field of ophthalmic research. Our group has been focused on the development of non-viral vectors for retinal pathologies and their optimisation to achieve higher transfection efficiencies. However, one of the main obstacles for a successful retinal gene therapy approach is the lack of vector tropism for retinal cells, in particular photoreceptors. Given this, we have taken an interest in retinol-binding protein 3 (RBP3) as it is one of few proteins known to interact with these cells. This protein is essential for the retinal function since it mediates retinoids’ extracellular diffusion in the visual cycle and prevents the potentially cytotoxic effects of their accumulation. One of the goals of this work was to explore the interaction of RBP3 with photoreceptors, as the ligands of this protein in the photoreceptor membrane are unknown. To achieve this, we first constructed the plasmids expressing RBP3 that were used throughout the study and verified their expression and secretion in vitro. Then, the interaction between RBP3 and photoreceptors was assessed by detecting RBP3 in lysates of photoreceptor-like cells grown in medium containing this protein. Our results showed a wash-resistant binding of RBP3 to these cells, supporting the hypothesis of a specific interaction between them. Another focus of this study was to assess the therapeutic potential of RBP3 overexpression in an animal model of retinal degeneration, as there are some reports in the literature on the benefits of Rbp3 administration. Therefore, we characterized RBP3 expression during the course of retinal degeneration in rd16 mice, a model for Leber’s congenital amaurosis. We observed that the photoreceptors of these animals are unable to express RBP3 even before the onset of degeneration, indicating that this is an early defect that may contribute to accelerate photoreceptor loss. Finally, we investigated the effect of subretinal administration of exogenous Rbp3 in newborn rd16 mouse pups. The results showed a decreased retinal degeneration in all injected eyes, however, further studies are needed to confirm that this outcome is indeed attributable to Rbp3 gene therapy. Overall, we demonstrated that RBP3 is a potential candidate to target non-viral vectors to photoreceptors. Furthermore, its noticeably stunted expression in rd16 mice from very early in development shows its potential as therapeutic target for gene therapy. However, further studies are needed to assess both of these applications.