Hypoxia-induced Quiescence: A New Approach on MSC Preservation

Abstract

As células estaminais mesenquimais (MSCs) provenientes do cordão umbilical (UC-MSCs) apresentam um enorme potencial terapêutico. Contudo, o sucesso das terapias com MSCs continua a revelar limitações associadas à baixa taxa de sobrevivência celular pós-transplantação e associadas à sua expansão prévia in vitro, em condições exógenas de oxigénio (O2). Estudos revelam que a hipoxia moderada poderá aumentar a proliferação em MSCs. No entanto, os resultados contraditórios relativos aos diferentes níveis de O2 utilizados e às diferentes origens de MSCs, criam dúvidas relativamente aos efeitos da hipoxia em UC-MSCs. Neste estudo, colocamos a hipótese de que UC-MSCs, quando expostas a níveis específicos de oxigénio previamente à transplantação, poderão atingir um estado quiescente que, ao minimizar a atividade celular e requisitos energéticos, poderá otimizar a sua sobrevivência, stemness, e potencial terapêutico. Pretendemos também criar um modelo de cloreto de cobalto (CoCl2) de UC-MSCs, comparando, a nível celular e molecular, os efeitos da hipoxia física com os deste composto. Para o efeito, as UC-MSCs foram expostas a vários níveis de O2 ou, alternativamente, a diversas concentrações de CoCl2. UC-MSCs cultivadas em hipoxia moderada e com 10 µM CoCl2 exibiram um perfil proliferativo superior ao das células cultivadas em normoxia, enquanto a hipoxia severa e o tratamento com 250 µM CoCl2, por seu turno, reduziram significativamente a proliferação, sem afetar a viabilidade. Concomitantemente, a análise proteica às 24 h revelou que apesar de não existirem variações significativas na atividade da mTOR, os efetores desta via, 4EBP1 e S6K1, demonstraram atividade reduzida nas células menos proliferativas, consistente com a diminuição na sua taxa proliferativa. Um switch para glicólise anaeróbica e a inibição da respiração mitocondrial é inferida pelo aumento da expressão de LDHA e a diminuição da expressão de COX IV nas células expostas às condições de hipoxia severa (<1% O2), característicos de um estado quiescente em MSCs, porém os nossos resultados mostram que células tratadas com CoCl2 diferem destas em termos metabólicos.Em suma, conseguimos estabelecer os efeitos diretos da hipoxia severa e moderada na proliferação, sobrevivência e metabolismo de UC-MSCs, e confirmar que a hipoxia severa, e o consequente estado hipoproliferativo que esta produz, pode aumentar a sobrevivência de UC-MSCs. Confirmamos também que este efeito está diretamente relacionado com uma inibição dos efetores da via mTOR, e estabelecer uma comparação direta entre níveis precisos de O2 e uma gama de concentrações de CoCl2, baseada nas semelhanças celulares e moleculares entre condições.

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) exhibit great therapeutic potential on account of their homing ability, differentiation capacity, immunomodulatory action, and immune-evading properties. Nevertheless, the success of UC-MSC based therapies is still limited by the low survival and engraftment rate post-implantation and by the precursory in vitro expansion outside physiological oxygen (O2) levels. Previous reports state that moderate hypoxia can increase MSC function and proliferation rates, yet contradictory results – regarding the differently sourced MSCs analyzed, and the different oxygen levels utilized – raises doubts concerning the effects of hypoxia on UC-MSCs. In this study we hypothesize that UC-MSCs exposed to specific O2 levels, prior to transplantation, can achieve a quiescent state that, by minimizing cell activity and energetic demand, might improve cell survival, stemness and therapeutic function. Additionally, we also intend to create a cobalt chloride (CoCl2) model for UC-MSCs, by comparing the cellular and molecular effects of physical hypoxia versus chemically induced hypoxia. To do so, UC-MSCs were cultured under several hypoxic O2 levels or were treated with different CoCl2 concentrations. UC-MSCs cultured under moderate hypoxia and 10 µM displayed higher population doubling than cells cultured in 21% O2, while culture under severe hypoxia or with 250 µM CoCl2 resulted in a significant decrease in proliferation, without affecting their viability. Concomitantly, protein analysis revealed that although phosphorylation of mTOR remained unchanged, the phosphorylation status of the effectors 4EBP1 and S6K1 was particularly downregulated in cells that displayed low proliferative profiles. A switch to anaerobiotic glycolysis and inhibition of mitochondrial respiration is implied by the rise of LDHA and downregulation of COX IV in cells exposed to severe hypoxia (<1% O2), yet our results revealed that cells treated with CoCl2 differed in terms of metabolism. In conclusion we were able to determine the direct effects of severe and moderate hypoxia on UC-MSC’s proliferation, survival, and metabolism, confirming that severe hypoxia, and a hypoproliferative state could increase UC-MSC survival. We also confirmed that this effect is directly linked to the mTOR pathway. Finally, we were able to establish a comparison between O2 levels and a range of CoCl2 concentrations, based on their cellular and molecular similarities.