Antiatherogenic Properties from Oleacein Extracted from Olive Tree and Olive Oil - Experimental Study in Animal Model

Abstract

A aterosclerose é o principal substrato para a maioria das doenças cardiovasculares (DCVs), que são a maior causa de mortalidade a nível mundial. Os fatores de risco para o desenvolvimento de aterosclerose e de outras DCVs, além dos não modificáveis, relacionam-se com estilos de vida pouco saudáveis, incluindo dietas hipercalóricas e hiperlipídicas, bem como sedentarismo. Estes fatores estão associados a outras doenças, tais como obesidade e esteatose hepática. Abordagens não farmacológicas, nomeadamente intervenções nutracêuticas, poderão servir como terapias adjuvantes às terapêuticas farmacológicas atualmente disponíveis. A Dieta Mediterrânica (MDiet), baseada numa grande variedade de alimentos pouco refinados, tem sido considerada como um modelo dietético por várias organizações internacionais. O azeite, uma das principais fontes de gordura da MDiet, composto essencialmente por ácidos gordos monoinsaturados, apresenta uma pequena pequena fração de compostos fenólicos, que têm sido vistos como uma opção nutracêutica, exibindo efeitos marcantes na prevenção destas doenças. Um dos mais promissores é a oleaceína (OLEA), um polifenol do grupo dos secoroidoides que já tem mostrado in vitro efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, sensibilizadores de insulina e ainda potencial para propriedades hipolipemiantes e antiateroscleróticas.Neste sentido, formulámos a hipótese de que uma intervenção nutracêutica com OLEA poderia exercer efeitos hepato e ateroprotetores num modelo animal susceptível ao desenvolvimento de aterosclerose, o murganho knockout para a apolipoproteina E (APOE KO) alimentado com uma dieta aterogénica (ATD). Desta forma, definimos duas abordagens experimentais. A primeira usando murganhos C57BL/6J wild-type (WT) com o objetivo de comparar os efeitos metabólicos de três regimes alimentares – i) dieta controlo padronizada não refinada (STD, n=8), ii) dieta refinada com baixo teor de gordura (LF, n=8) e iii) dieta refinada aterogénica (ATD, n=8) - ao nível dos perfis glicémico, insulinémico e lipídico. A segunda avaliando o potencial efeito hepatoprotetor, antidislipidémico e anti-aterosclerótico da OLEA no murganho APOE KO, onde se definiram dois grupos - com e sem tratamento com 50 mg/kg/dia de OLEA (n=8 cada) – comparados com um grupo WT alimentado com ATD. Todos os grupos experimentais tiveram alimento e água fornecidos ad libitum.Os perfis glicémicos e insulinémicos foram avaliados nos tempos inicial e final e o perfil lipídico foi caracterizado em termos de valores séricos de colesterol total (c-Total), TGs, c-LDL e c-HDL, bem como de conteúdos hepáticos de TGs. Utilizou-se marcações histomorfológicas e observações de microscopia eletrónica de varrimento (SEM) para caracterizar as lesões hepáticas e vasculares e a deposição lipídica. Avaliou-se também os níveis séricos e hepáticos de SOD e quantificou-se a expressão hepática de SOD-1 e SOD-2 por RT-PCR.Os animais WT alimentados com ATD apresentaram um aumento significativo do peso corporal, sem alterações de tolerância à glicose ou de sensibilidade à insulina. Constatou-se existir no mesmo grupo um aumento da concentração sérica de c-Total, c-LDL e c-HDL, acompanhado de acumulação de TGs no fígado. Além disso, exibiram reduzida expressão hepática de ambas as isoformas de SOD, o que pode ser indicativo de um processo de stress oxidativo característico destas doenças.Os animais alimentados com a dieta LF apresentaram alterações metabólicas mais moderadas do que os submetidos a ATD, incluindo uma tendência para valores superiores de glucose circulante após 6 horas em jejum, bem como um aumento da concentração sérica de c-Total, c-LDL e c-HDL, e de TGs hepáticos, quando comparados com os animais alimentados com STD, sugerindo que a presença de ingredientes refinados nesta dieta, embora que com baixo teor de gordura, não impede um impacto negativo no metabolismo, comparativamente à dieta STD não refinada.Em relação à segunda abordagem experimental, constatou-se (por H&E e SEM) existirem lesões vasculares nos animais APOE KO compatíveis com a literatura. A OLEA apresentou um efeito marcante no perfil lipídico dos murganhos APOE KO, causando uma redução marcada dos valores séricos de c-Total, c-LDL, c-HDL e TGs, bem como uma forte atenuação da concentração hepática de TGs. Estes dados foram corroborados pelas marcações hepáticas com Oil Red O e H&E, verificando-se um efeito marcado anti-dislipidémico nos murganhos APOE KO. Não se observaram diferenças significativas nos perfis glicémicos e insulinémicos entre os 3 grupos.Globalmente, verifica-se que a suplementação com OLEA melhorou significativamente o perfil lipídico dos murganhos APOE KO, com forte proteção contra a deposição lipídica hepática e eventual efeito antioxidante. Mais estudos serão necessários para clarificar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à proteção contra o desenvolvimento de esteatose hepática neste modelo de hiperlipidema e aterosclerose.

Atherosclerosis is the main substrate for most cardiovascular diseases (CVDs) which are the main cause of mortality worldwide. The risk factors for the development of atherosclerosis and CVDs, in addiction to non-modifiable are related to unhealthy lifestyles, including hypercaloric and hyperlipidic diets, as well as sedentary lifestyle. These factors are associated with other diseases, such as obesity and hepatic steatosis. The non-pharmacological approaches, namely nutraceutical interventions, can serve as adjuvant approaches to the currently available pharmacologic therapies. The Mediterranean Diet (MDiet), based on a wide variety of unrefined foods, has been considered a dietary model by several international organizations. Olive oil, one of MDiet's main sources of fat, composed essentially of monounsaturated fatty acids, has a small fraction of phenolic compounds, which have been seen as a nutraceutical option, exhibiting marked effects in preventing these diseases. One of the most promising is oleacein (OLEA), a polyphenol from the secoiridoids group that has already shown in vitro antioxidant, anti-inflammatory, insulin sensitizing effects and even potential for lipid-lowering and anti-atherosclerotic properties.In this sense, we hypothesized that a nutraceutical intervention with OLEA could exert hepato- and atheroprotective effects in an animal model susceptible to the development of atherosclerosis, the apolipoprotein E (APOE KO) knockout mouse fed an atherogenic diet (ATD). In this way, we define two experimental approaches. The first using C57BL/6J wild-type (WT) mice to compare the metabolic effects of three diets – i) unrefined standardized control diet (STD, n=8), ii) refined low-fat diet (LF, n=8) and iii) atherogenic refined diet (ATD, n=8) - at the level of glycemic, insulinemic and lipid profiles. The second evaluating the potential hepatoprotective, anti-dyslipidemic and anti-atherosclerotic effect of OLEA in the APOE KO mouse, where two groups were defined - with and without treatment with 50 mg/kg/day of OLEA (n=8 each) - compared with a WT group fed with ATD. All experimental groups had food and water provided ad libitum.The glycemic and insulinemic profiles were evaluated in the initial and final times and the lipid profile was characterized in terms of serum values of total cholesterol (c-Total), TGs, c-LDL and c-HDL, as well as hepatic contents of TGs. Histomorphological markings and scanning electron microscopy (SEM) observations were used to characterize liver and vascular lesions and lipid deposition. Serum and hepatic SOD levels were also evaluated and the hepatic expression of SOD-1 and SOD-2 was quantified by RT-PCR.WT animals fed with ATD showed a significant increase in body weight, without changes in glucose tolerance or insulin sensitivity. It was found that in the same group there was an increase in the serum concentration of c-Total, c-LDL and c-HDL, accompanied by accumulation of TGs in the liver. In addition, they exhibited reduced hepatic expression of both SOD isoforms, which may be indicative of an oxidative stress process characteristic of these diseases.The animals fed the LF diet showed more moderate metabolic alterations than those submitted to ATD, including a trend towards higher values of circulating glucose after 6 hours of fasting, as well as an increase in the serum concentration of c-Total, c-LDL and c-HDL, and liver TGs, when compared to animals fed with STD, suggesting that the presence of refined ingredients in this diet, although low in fat, does not prevent a negative impact on metabolism, compared to the unrefined STD diet.Regarding the second experimental approach, it was found (by H&E and SEM) that there were vascular lesions in APOE KO animals compatible with the literature. OLEA had a marked effect on the lipid profile of APOE KO mice, causing a marked reduction in the serum values of c-Total, c-LDL, c-HDL and TGs, as well as a strong attenuation of the hepatic concentration of TGs. These data were corroborated by the liver markings with Oil Red O and H&E, showing a marked anti-dyslipidemic effect in the APOE KO mice. There were no significant differences in glycemic and insulinemic profiles between the 3 groups.Overall, it appears that supplementation with OLEA significantly improved the lipid profile of APOE KO mice, with strong protection against hepatic lipid deposition and an eventual antioxidant effect. Further studies will be needed to clarify the cellular and molecular mechanisms underlying protection against the development of hepatic steatosis in this model of hyperlipidema and atherosclerosis.