Optimization of the recovery of extracellular vesicles from filamentous fungi

Abstract

Nas últimas décadas, tem sido relatada uma crescente ocorrência de infeções fúngicas, principalmente devido ao aumento do número de imunocomprometidos. O sistema imunitário do hospedeiro é o fator determinante da forma particular de doença que se pode desenvolver após a exposição aos fungos. Alternaria alternata é um agenteoportunista raro e causa doenças alérgicas respiratórias. É omnipresente no meio ambiente, os seus esporos são inalados diariamente e Alternaria spp. são colonizadores do trato respiratório.As Vesículas Extracelulares (EVs) são identificadas como mediadoras da comunicação entre as células, são capazes de transportar enzimas, proteínas entre outros compostos e tem sido relatado a presença destas estruturas durante o desenvolvimento de diferentes patologias humanas e doenças infeciosas.O principal objetivo deste estudo foi otimizar o protocolo de isolamento de EVs de fungos filamentosos e, posteriormente, caracterizar essas EVs fúngicas e avaliar a sua interação com células imunitárias, nomeadamente, macrófagos. A. alternata foi usada como organismo modelo. Para isso, otimizou-se a cultura de A. alternata e observou-se que o meio que apresentou melhor rendimento de EVs foi o meio mínimo sólido. A metodologia de isolamento de EVs utilizada foi baseada na centrifugação diferencial com etapas de lavagem de PBS; tampões iso-osmóticos e outros protocolos de isolamento como gradiente de sacarose foram também testados.Em seguida, as EVs foram caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e por microscopia eletrónica de transmissão (TEM), revelando partículas com forma e tamanho típicos de 132,9 +/- 1,3 nm, conforme determinado por NTA, e 115,2 +/- 5,7 nm , conforme determinado por TEM. A extração de proteínas das EVs de A. alternata para análise proteómica foi otimizada. Os géis SDS-PAGE indicaram que as proteínas destas EVs consistem numa banda proeminente de cerca de 35 kDa, indicando que esta proteína (ou grupo de proteínas) é de grande importância para a biologia e / ou comunicação fúngica. A fim de avaliar se as EVs desempenhariam um papel crucial na resposta imune, foi avaliada sua interação com macrófagos. Primeiramente, foi avaliada a citotoxicidade das EVs em macrófagos usando o ensaio de viabilidade de Trypan Blue em 1h e 3h de incubação. Os resultados não mostraramcitotoxicidade significativa para a linha celular estudada, macrófagos RAW264.7. Nos ensaios de interação, foi quantificada a expressão dos genes TNF-α e IL1-β após 3 h de exposição. No que diz respeito à expressão do gene que codifica para TNF-α, os resultados mostraram que 10 μg / mL de EVs levaram a maior expressão génica do que a exposição a 1 μg / mL de EVs, mas sem significância estatística. Para a expressão do gene IL1-β, os resultados preliminares apontam para um baixo aumento na expressão do gene quando os macrófagos foram incubados com 10 μg / mL de EVs. Embora a abordagem para estudar a resposta imune a EVs de A. alternata não tenha sido conclusiva e necessite de estudos futuros, um resultado importante deste trabalho foi a confirmação de que a melanina pode ser usada como um biomarcador de EVs em fungos que produzem melanina, sendo que até agora, não há biomarcadoresdisponíveis para EVs de fungos filamentosos.

In the last decades a growing occurrence of fungal infections has been reported, mainly because the increased number of immunocompromised. The host's immune system is the determining factor of the particular form of disease that may develop after exposure to fungi. Alternaria alternata is a rare opportunistic agent of infection and causes respiratory allergic diseases. It is ubiquitous in the environment; its spores are daily inhaled and Alternaria spp. are colonizers of the respiratory tract.Extracellular vesicles (EVs) are identified as mediators of communication between cells; are capable of transporting enzymes, proteins and other compounds and it has been reported that these structures circulate during the development of different human pathologies and infectious diseases.The main objective of this study was to optimize the isolation protocol of EVs from filamentous fungi, and then, to make its characterization and to evaluate their interaction with immune cells, namely, macrophages. A. alternata was used as a model organism. To accomplish that, it was optimized the A. alternata culture and it was observed that the culture medium that led to the best EVs yield was the solid minimal medium. The EVs isolation methodology used was based on differential centrifugation with PBS washing steps; iso-osmotic buffers and other isolation protocols as sucrose gradient were also tested.The EVs were characterized using nanoparticle tracking analysis (NTA) and by transmission electron microscopy (TEM), revealing that particles with typical shape and size of 132.9 +/- 1.3 nm, as determined by NTA, and 115.2 +/- 5.7 nm, as determined by TEM. The extraction of the proteins from A. alternata EVs for proteomic analysis, wasoptimized. SDS-PAGE gels indicated that the EVs proteins consist of a prominent band of around 35 kDa, indicating that this protein (or group of proteins) is of major importance for the fungal biology and/or communication. In order to assess whether EVs would play a crucial role in the immune response, it was evaluated their interaction with macrophages. First, it was evaluated the cytotoxicity of EVs on macrophages using the Trypan Blue viability assay at 1 h and 3 h of incubation. The results did not show significant cytotoxicity for the cell line studied, RAW264.7 macrophages. In the interaction assays, it was quantified the TNF-α and IL1-β gene expression upon 3 h exposure period. In what concerns the expression of the gene coding for TNF-α, the results showed that 10 μg/mL of EVs led to higher gene expression than exposure to 1 g/mL of EVs, but with no statistical significance. For IL1-β gene expression, the preliminary results point to a low increase in gene expression when the macrophages were incubated with 10 μg/mL of EVs.Although the approach to study the immune response to A. alternata EVs was not conclusive and requires future studies, an important output of this work was the confirmation that melanin can be used as an EVs biomarker in fungi that produce melanin, since until now, there are no biomarkers available for filamentous fungi EVs.