Synthesis and Characterization of a Biocompatible Fluorinated Mn(III)-Porphyrin as a Redox Responsive 19F-NMR/T1 Bimodal MRI Contrast Agent.

Abstract

De entre as diferentes técnicas de imagem, a ressonância magnética nuclear de processos químicos e fisiológicos tem vindo a ganhar maior destaque. A MRI é uma técnica bastante vantajosa, dada a sua capacidade de gerar imagens de tecidos profundos com alta resolução temporal e sensibilidade. A vantagem de 19F MRI advêm da ausência de sinal de flúor in vivo e da extensa janela química de 19F, o que permite detetar simultaneamente mais do que uma sonda. O desenvolvimento da técnica de 19F MRI deve-se ao design de novas sondas perfluoradas, com parâmetros de imagem melhorados devido à incorporação de iões paramagnéticos. De acordo com a teoria de Bloch-Wangsness-Redfield, vários fatores podem afetar a sensibilidade das sondas perfluoradas, como a distância internuclear, tempos de correlação rotacional, geometria, bem como o estado de oxidação e estado de spin do ião metálico. Nesta dissertação foi sintetizada uma nova porfirina – Mn(III)TPP-p-CF3 para aplicação em 19F MRI como sonda “turn-off” redox. A incorporação com manganês, que é um ião paramagnético, tem como objetivo reduzir o tempo de relaxação T1, permitindo a aquisição de sinal com intensidade suficiente num período de tempo razoável. A sonda foi caracterizada por estudos de absorção UV-Vis e 1H/19F RMN. Para o desenvolvimento de sondas MRI sensíveis ao ambiente redox baseadas em MnIII/MnII, a complexação estável das formas reduzida e oxidada do metal, bem como o ajuste apropriado do potencial redox numa faixa biologicamente relevante são fatores essenciais. A porfirina sintetizada, que é insolúvel em água, satisfaz ambos os requisitos. Em solução aquosa, consegue alternar reversivelmente entre os estados de oxidação MnIII/MnII. Na presença de ácido ascórbico (um dos principais antioxidantes), o MnIII sofre uma redução lenta, que é revertida com a exposição ao oxigénio do ar. No entanto, o complexo não é reduzido pela glutationa. Este facto deve-se à coordenação dos grupos carboxilo da glutationa ao MnIII, em posição axial. A inclusão com γ-CD visa aumentar a hidrossolubilidade do complexo, considerando a sua capacidade de formar complexos de inclusão não covalentes com moléculas hóspedes hidrofóbicas. Através de 19F RMN foi confirmada a inclusão dos grupos CF3 da porfirina na cavidade hidrofóbica da γ-CD. Embora o complexo γ-CD*Mn(III)TPP-p-CF3 também seja reduzido na presença de ácido ascórbico, a inclusão com γ-CD estabiliza ambos os estados de oxidação MnIII/MnII, mesmo na ausência de ácido ascórbico, o que pode comprometer a sua aplicabilidade como sonda redox. Apesar de a estequiometria entre os dois compostos não ter sido determinada experimentalmente, é esperada uma estequiometria de 2:1 (γ-CD:Mn(III)TPP-p-CF3). De uma forma geral, não foi detetada citotoxicidade in vitro na linha celular humana Caco-2 para ambos os complexos, embora as concentrações utilizadas não cobrissem a faixa de concentrações típica para aplicação em MRI.

Among the different imaging techniques, magnetic resonance imaging of chemical and physiological processes is becoming widespread. MRI is a powerful tool given its ability to image deep inside tissue with high temporal resolution and sensitivity. The strength of 19F MRI comes from the negligible background signal in in vivo 19F MRI and the broad chemical shift window of 19F, making it possible to image more than one marker. Much of the grown of 19F MRI can be assigned to novel designs of 19F probes, which have improved imaging parameters due to the incorporation of paramagnetic ions. According to Bloch-Wangsness-Redfield theory, several parameters may affect the sensitivity of the fluorine-based probes, such as internuclear distance, rotational correlation times, geometry, as well as oxidation state and spin state of the metal ion. In this dissertation, a novel porphyrin – Mn(III)TPP-p-CF3 has been designed and synthesized to work as a “turn-off” redox probe for application in 19F MRI. The incorporation with manganese, which is a paramagnetic metal ion, has the purpose to reduce T1 relaxation time, allowing the acquisition of sufficient signal intensity in a reasonable period of time. The former probe was characterized by both UV-Vis absorption and 1H/19F NMR studies. For the development of redox responsive MRI probes based on the MnIII/MnII couple, it is mandatory a stable complexation of both reduced and oxidized forms of the metal and appropriate tuning of the redox potential in a biologically relevant range. The non-water-soluble fluorinated Mn-porphyrin derivative satisfies both requirements. In aqueous solution, it can reversibly switch between MnIII/MnII oxidation states. In the presence of ascorbic acid (one of the most important antioxidants), the MnIII undergoes a slow reduction, reversed in the presence of air oxygen. However, the complex is not reduced by glutathione. This event is prevented by the coordination of the glutathione carboxylate groups to the MnIII in the axial position. The inclusion of Mn(III)TPP-p-CF3 into γ-CD aims to increase the probe hydrosolubility, considering their ability to form noncovalent inclusion complexes with hydrophobic guest molecules. 19F NMR confirmed the inclusion of the meso aryl groups (CF3) of the porphyrin into the γ-CD hydrophobic cavity. Although the γ-CD*Mn(III)TPP-p-CF3 complex is also reduced by ascorbic acid, the inclusion with CD stabilizes both MnIII and MnII oxidation states even in the absence of ascorbic acid, which may compromise its application as a redox responsive probe. The stoichiometry between the two compounds was not possible to determine experimentally, but it is expected to have a 2:1 stoichiometry (γ-CD:Mn(III)TPP-p-CF3). Overall, no in vitro cytotoxicity in the human Caco-2 cell line was detectable for both complexes, even though the concentrations used were not in the typical MRI imaging concentration range.