Diagnóstico pré natal não invasivo - Sequenciação de Nova Geração

Abstract

O diagnóstico pré-natal combina um conjunto de testes realizados durante a gestação de modo a detetar possíveis complicações na formação do embrião. Atualmente, as técnicas usadas podem ser caracterizadas em invasivas e não invasivas, sendo o foco deste trabalho a recolha e análise do cell free fetal DNA (cffDNA) livre em circulação no sangue materno, descoberto em 1997 por Dennis Lo. O NIPT, do inglês non-invasive pre natal test tem por base a extração destes fragmentos de cell free DNA e a sua sequenciação através de técnicas de Sequenciação de Nova Geração (NGS). Esta técnica permite analisar vários parâmetros como a presença de aneuploidias, o sexo fetal, e o genótipo RhD, evitando em cerca de 90% o uso de técnicas de diagnóstico invasivas, muitas vezes pouco aceites pelos progenitores devido a estarem associadas a perda fetal. Contudo, o foco deste teste é a deteção de aneuploidias, mais concretamente as aneuploidias ligadas aos cromossomas 13, 18, 21 e aos cromossomas sexuais, pelo facto de serem as aneuploidias com uma maior taxa de incidência. Existem vários fatores que podem levar ao aparecimento destas alterações numéricas, sendo por isso importante a implementação de técnicas que permitam detetá-las ainda numa fase precoce, como é o caso do NIPT que pode ser realizado logo após as 10 semanas de gestação. A técnica NGS pode ser executada através de várias tecnologias, no entanto a usada para elaboração deste relatório foi através de genotipagem, usando SNPs. Esta tecnologia permite selecionar regiões alvo, amplifica-las e sequencia-las. Após a sequenciação, é feita uma comparação entre os fragmentos e é calculada uma fração fetal, que irá permitir determinar o risco de ocorrência de aneuploidias nos cromossomas em estudo.

Prenatal diagnosis combines a set of tests performed during gestation in order to detect possible complications in embryo formation. Currently, the techniques used can be characterised in invasive and non-invasive, being the focus of this work the collection and analysis of cell free fetal DNA (cffDNA) circulating in maternal blood, discovered in 1997 by Dennis Lo. The NIPT, non-invasive pre natal test is based on the extraction of these cell free DNA fragments and their sequencing using Next Generation Sequencing (NGS) techniques. This technique allows the analysis of several parameters, such as the presence of aneuploidies, fetal gender and RhD genotype, avoiding by 90% the use of invasive diagnostic techniques, which are often not accepted by parents due to their association with fetal loss. However, the focus of this test is the detection of aneuploidies, more specifically aneuploidies linked to chromosomes 13, 18, 21 and to sex chromosomes, due to the fact that these are the aneuploidies with the highest incidence rate. There are several factors that may lead to the appearance of these numerical alterations, and for this reason it is important to implement techniques that allow detecting them at an early stage, such as the NIPT that may be performed right after the 10th week of gestation. The NGS technique can be carried out through various technologies, however the one used for the preparation of this report was through genotyping, using SNPs. This technology allows selecting target regions, amplifying and sequencing them. After sequencing, a comparison is made between the fragments and a fetal fraction is calculated, which will allow determining the risk of aneuploidies occurring in the chromosomes under study.