Novel molecular targets and therapeutic strategies for Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome's cardiovascular system

Abstract

O envelhecimento consiste no maior fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV), a principal causa de morte mundial. De facto, o coração sofre várias alterações ao longo da vida, com um comprometimento progressivo da função dos cardiomiócitos (CM). O envelhecimento cardíaco fisiológico é caracterizado pelo aumento de marcadores fibróticos, uma limitada regeneração do miocárdio, desenvolvimento de hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE), um declínio da função diastólica do VE, entre outros.Nos últimos 10 anos, síndromes de envelhecimento prematuro, tais como o síndrome de progeria de Hutchinson Gilford (HGPS) têm vindo a ser utilizados como modelos para estudar o envelhecimento cardiovascular. HGPS é uma doença rara caracterizada como um envelhecimento acelerado e que é causada por uma mutação no gene LMNA, que leva à acumulação de um isoforma de Lamin A – a progerina. Os pacientes de HGPS possuem uma esperança média de vida de 14.6 anos, geralmente falecendo de enfarte do miocárdio, falência cardíaca ou acidente vascular cerebral, apresentam várias anomalias cardíacas semelhantes e possuem várias alterações em comum com envelhecimento fisiológico cardiovascular.Existem várias evidências que a senescência, um processo no qual as células saem do ciclo celular mantendo-se metabolicamente ativas, participa no desenvolvimento dos fenótipos observados em DCV e em HGPS. A eliminação farmacológica destas células senescentes, por via de senoterapêuticos, tem sido uma estratégia que tem vinto a revelar vários resultados positivos, apontando para um papel benéfico destes compostos. No entanto, o estudo do impacto destes em células com HGPS ainda está muito pouco explorado.Por outro lado, a fisiopatologia cardíaca no contexto de HGPS tem sido pouco investigada, nomeadamente por falta de biópsias humanas ou bons modelos in vitro. Alguns ensaios pré-clínicos e clínicos para tratamentos para HGPS têm vindo a ser propostos para HGPS que se baseiam em inibidores da farnesyltransferase e/ou rapamicina. No entanto o seu impacto na condição cardíaca ainda não está totalmente compreendido.Nesse sentido, neste trabalho: i) avaliámos o efeito a longo prazo (10 dias) de senoterapêuticos em fibroblastos de HGPS utilizando fisetina e ABT263, tendo sido avaliado o seu impacto em marcadores de senescência e perfil metabólico; ii) caracterizámos o fenótipo de HGPS especificamente no VE de um modelo animal de HGPS (LmnaG609G/G609G ); iii) comparámos, a nível do proteoma, este modelo animal com murganhos envelhecidos naturalmente, a fim de descobrir hits comuns; e iv) avaliámos se CM derivados de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC-CM) (de doentes com HGPS) recapitulavam as alterações observadas dos hits identificados.O tratamento com fisetina não apresentou qualquer efeito terapêutico em nenhuma das concentrações testadas. Por outro lado, o fármaco ABT263 apresentou uma redução significativa dos parâmetros de senescência com tratamentos de 20 e 40 µM, e o tratamento com 20 µM apresentou uma tendência para uma melhoria dos parâmetros metabólicos. Estes resultados evidenciam as vantagens de usar senoterapia para tratar o HGPS. Nesta tese é reportada, pela primeira vez, a acumulação de progerina em CMs do tecido do VE de murganhos LmnaG609G/G609G. Além disso, a análise proteómica levada a cabo revelou que vias relacionadas com senescência estão promovidas no VE de ratinhos LmnaG609G/G609G e a identificaram-se duas proteínas, FHL2 e CRIP2, expressas a níveis elevados no coração e mais especificamente em CM, como tendo níveis diminuídos tanto em envelhecimento fisiológico com em HGPS. De notar, confirmamos que estas proteínas estão reduzidas in vivo no VE de murganhos LmnaG609G/G609G e que as HGPS-iPSC-CMs humanas recapitulam este fenótipo.Em conclusão, foi demonstrado que a administração prolongada de ABT263 pode vir a ser uma perspetiva futura para uma nova terapia para pacientes com HGPS e que ratinhos HGPS apresentam a acumulação de progerina em CM no VE. Simultaneamente estes têm uma redução nos níveis de CRIP2 e FHL2, um fenótipo partilhado com ratinhos envelhecidos naturalmente e em HGPS-iPSC-CMs humanos, o que pode representar um possível papel destas duas proteínas na patologia cardíaca de HGPS e no envelhecimento cardíaco humano.

Aging is the main factor risk of cardiovascular diseases (CVDs), the major cause of death worldwide. In fact, the heart suffers multiple changes throughout life, with cardiomyocyte (CM) function becoming progressively compromised. Physiological cardiac aging is characterized by enhanced fibrosis, limited myocardial regeneration, left ventricular (LV) hypertrophy, a decline in LV diastolic function, among others. In the last 10 years, premature aging-like syndromes, such as Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS), have been used as models to study cardiovascular aging. HGPS is a rare disease characterized as an accelerated aging that is caused by a mutation in the LMNA gene, leading to the accumulation of a lamin A isoform - progerin. HGPS patients die at a mean age of 14.6 years, usually of myocardial infarction, heart failure or stroke and they present several cardiac abnormalities and share many features of cardiovascular physiological aging. Cumulative evidence has been shown that senescence, a process where cells enter permanent cycle arrest while remaining metabolically active, plays a role in CVDs and HGPS pathological phenotypes. Pharmacological elimination of senescent cells in CVDs, using senotherapeutics, has been pointed out as a strategy with positive outcomes, revealing a beneficial role for these compounds. However, their effects over HGPS cells remains largely underexplored. Also, the cardiac pathophysiology in HGPS has been poorly investigated due to the lack of human biopsy materials or good in vitro models. Some encouraging pre-clinical and clinical treatments have been proposed in the last years for HGPS based on farnesyltransferase inhibitors and/or rapamycin. However, the impact of these therapies on the cardiac tissue remains to be determined.Therefore, in this work, we: i) performed long-term (10 days) senotherapeutic treatments in HGPS fibroblasts using fisetin and ABT263 and assessed their effect on senescence phenotype and metabolic profile; ii) characterized the HGPS phenotype specifically on the left ventricle (LV) tissue of a HGPS mouse model (LmnaG609G/G609G); iii) compared, at the proteome level, these animals with naturally aged mice, to unveil commonly altered hits; and iv) evaluated if human induced pluripotent stem cell-derived CMs (originated from a HGPS patient) (HGPS-iPSC-CMs) recapitulated the changes associated with those hits.Fisetin presented no overall therapeutic range in HGPS fibroblasts, while ABT263 displayed a significant reduction of senescence markers with 20 and 40 µM concentrations. Moreover, 20 µM treatment presented a tendency for an improved metabolic profile. These results highlight the advantages of using senotherapy to treat HGPS. In this thesis we reported, for the first time, that progerin accumulation occurs in CMs in LmnaG609G/G609G LV tissue. Moreover, comparative proteomic analysis revealed that senescence-related pathways were upregulated in the LmnaG609G/G609G LV tissue and that the molecular hits CRIP2 and FHL2, which are highly expressed in hearts and particularly in CMs, were downregulated in both naturally aged and HGPS mice. Importantly, we confirmed that these proteins were downregulated in vivo in LmnaG609G/G609G mice LV tissue and that human HGPS-iPSC-CMs recapitulated this phenotype.In conclusion, we showed that long-term ABT263-based treatment might represent an interesting future therapeutical approach for HGPS patients and that HGPS mice present progerin accumulation and downregulation of CRIP2 and FHL2 in the LV, the latter phenotype shared with naturally aged mice and human HGPS-iPSC-CMs, thus pointing that these hits might have a role in human HGPS pathology and in human cardiac aging.