Mecanismos de ação do plasma frio atmosférico contra o cancro da bexiga

Abstract

Mundialmente, o cancro da bexiga é o 10º tumor com maior incidência e o 13º com maior mortalidade. Os medicamentos atualmente disponíveis para uso clínico não têm a eficácia desejada e apresentam efeitos secundários. O Plasma Frio Atmosférico (PFA) é um gás parcialmente ionizado, produzido a uma temperatura abaixo dos 40°C. O PFA pode ser aplicado através de um meio à base de água primeiramente exposto ao Plasma Frio Atmosférico e depois colocado em contacto com células ou tecidos, o meio ativado por PFA (MAP). Acredita-se que os mecanismos de ação do MAP provenham das espécies reativas de oxigénio e nitrogénio que se formam durante a interação do jato de PFA com o meio e das que se formam no meio. O principal objetivo deste trabalho experimental foi avaliar o potencial terapêutico dos MAPs contra o cancro da bexiga. Para este trabalho foi utilizado um dispositivo eletrónico capaz de gerar uma descarga de alta tensão para produzir PFA. Avaliou-se o potencial citotóxico do tratamento com os meios ativados por PFA em diferentes linhas celulares de cancro da bexiga: TCCSUP (grau IV) e HT1376 (grau III). Numa fase inicial, expuseram-se vários meios (água destilada, água ultra-pura, PBS e NaCl) ao PFA, durante diversos tempos de exposição (30, 60, 90, 120, 180 e 240 segundos) e, posteriormente, transferiram-se para as células. O efeito destes meios foi avaliado pela medição da atividade metabólica e do conteúdo proteico, após 24, 48 e 72 horas de tratamento. Os ensaios subsequentes foram realizados apenas com o NaCl, para o tempo de tratamento de 24 horas e tempos de exposição do NaCl ao PFA de 30, 60 e 120 segundos. Diversos ensaios de citotoxicidade foram realizados para averiguar o efeito do NaCl ativado por PFA como o perfil de morte celular e alterações no ciclo celular. Sabendo-se de antemão pelo descrito na literatura que a produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio é o mecanismo de ação mais provável que mediará a ação indireta do PFA, procedeu-se à medição da produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio, no NaCl ativado por PFA na ausência de células, assim como, a nível intracelular. Numa perspetiva translacional, foram realizados estudos ex vivo para avaliação do efeito do NaCl ativado por PFA em amostras de tumor da bexiga. As amostras foram recebidas, expostas ao NaCl ativado por PFA durante 60, 120 e 180 segundos. Após 24, 48 e 72 horas o efeito do tratamento foi avaliado através de análise histológica utilizando coloração com Hematoxilina-Eosina e imuno-histoquímica para avaliar a expressão de Ki67 e caspase-3.Relativamente aos estudos in vitro, o tratamento com meios ativados por PFA induziu diminuição da atividade metabólica. A linha celular TCCSUP demonstrou ser mais sensível ao tratamento. A diminuição da proliferação das células de cancro da bexiga é mais acentuada utilizando NaCl ativado por PFA do que utilizando o tratamento direto com PFA. O NaCl ativado por PFA diminuiu a viabilidade celular e provocou um aumento da morte celular por apoptose tardia e necrose. Foi observado um bloqueio do ciclo celular na fase S, nas duas linhas celulares, e um bloqueio na fase G2/M na linha celular HT1376, o que pode indicar diminuição da síntese de DNA e/ou lesões no DNA. Em relação à produção de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio no NaCl ativado por PFA, na ausência de células, houve um aumento significativo do nível das mesmas com apenas 30 segundos de exposição. Quanto ao conteúdo intracelular das espécies reativas, os resultados revelam um aumento do radical superóxido e óxido nítrico na linha celular TCCSUP, indicando que estas espécies podem desempenhar um papel importante no mecanismo de ação do NaCl ativado por PFA. Em relação aos estudos ex vivo, após tratamento observou-se aumento da necrose e redução da coesão celular. Portanto, os resultados obtidos sustentaram a aplicabilidade clínica do NaCl ativado por PFA, visto que o seu efeito foi notório não só num modelo bidimensional mais simples, mas também num modelo 3D mais complexo. Estes resultados reforçam a necessidade de mais estudos, principalmente a avaliação da seletividade do tratamento, utilizando células normais da bexiga. Por fim, tendo em consideração que a utilização de NaCl para irrigação da bexiga após resseção transuretral da bexiga é uma prática comum na clínica, a substituição do NaCl por NaCl ativado por PFA pode representar uma abordagem terapêutica promissora no tratamento neoadjuvante do cancro da bexiga.

Worldwide, Bladder cancer is the 10th tumor with the highest incidence and the 13th with the highest mortality worldwide. Drugs currently available for clinical use do not have the desired efficacy and show side effects. Cold atmospheric Plasma (CAP) is a partially ionized gas, produced at a temperature below 40°C. CAP can be applied through a water-based media first exposed to CAP and then placed into contact with cells or tissues, the CAP-activated media (PAM). It is believed that the mechanisms of action of PAM come from the reactive species of oxygen and nitrogen formed during the interaction of the jet of CAP with the media and formed after secondary reactions of those. The main objective of this experimental work was to evaluate the therapeutic potential of CAP-activated media against bladder cancer. For this work an electronic device capable of generating a high voltage discharge was used to produce CAP. The cytotoxic potential of treatment with PAM was evaluated in different cell lines of bladder cancer: TCCSUP (grade IV) and HT1376 (grade III). In an initial phase, several media (distilled water, ultra-pure water, PBS and NaCl) were exposed to CAP, during different exposure times (30, 60, 90, 120, 180 and 240 seconds) and, subsequently, transferred to the cells. The effect of these media was evaluated by measuring metabolic activity and protein content after 24, 48 and 72 hours of treatment. The subsequent tests were carried out only with NaCl, for a treatment time of 24 hours and exposure times of NaCl to CAP of 30, 60 and 120 seconds. Several cytotoxicity assays were carried out to investigate the effect of NaCl activated by CAP as the cell viability and death profile, and alterations in the cell cycle. Knowing in advance from what has been described in the literature that the production of reactive oxygen and nitrogen species is the most likely mechanism of action that will mediate the indirect action of the CAP, the production of reactive oxygen and nitrogen species was measured in NaCl activated by CAP in the absence of cells and at intracellular level. From a translational perspective, ex vivo studies were carried out to evaluate the effect of NaCl activated by CAP in bladder tumor samples. The samples were received, exposed to NaCl activated by CAP for 60, 120 and 180 seconds. After 24, 48 and 72 hours the treatment effect was evaluated by histological analysis using hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry to assess the expression of Ki67 and caspase-3. Regarding in vitro studies, treatment with PAM induced a decrease in metabolic activity. TCCSUP cell line has been shown to be more sensitive to treatment. The decrease in proliferation of bladder cancer cells is more pronounced using NaCl activated by CAP than using direct treatment with CAP. CAP-activated NaCl decreased cell viability and caused an increase in cell death by late apoptosis and necrosis. A cell cycle arrest in S phase was observed in both cell lines, and additionally a blockade in G2/M phase in HT1376 cell line, which may indicate decreased DNA synthesis and/or DNA damage. Regarding the production of reactive oxygen and nitrogen species in NaCl activated by CAP, in the absence of cells, there was a significant increase in those levels with only 30 seconds of exposure. As for the intracellular content of the reactive species, the results revealed an increase in superoxide and nitric oxide radicals in TCCSUP cell line, indicating that these species may play an important role in the mechanism of action of NaCl activated by CAP. Regarding the ex vivo studies, after treatment there was an increase in necrosis and a reduction in cell cohesion.Therefore, the results obtained support the clinical applicability of NaCl activated by CAP, since its effect was notable not only in a simpler two-dimensional model, but also in a more complex 3D model. These results reinforce the need for further studies, especially the evaluation of treatment selectivity, using normal bladder cells. Finally, considering that the use of NaCl for bladder irrigation after transurethral resection of the bladder is common clinical practice, the replacement of NaCl by NaCl activated by CAP may represent a promising therapeutic approach in the neoadjuvant treatment of bladder cancer.