Photodynamic therapy as an innovative approach to Endometrial Cancer Stem Cells

Abstract

O cancro do endométrio (EC, do inglês Endometrial Cancer) representa cerca de 6% dos cancros no sexo feminino, sendo a doença maligna ginecológica mais frequente em países desenvolvidos. A cirurgia radical é o tratamento primário mas em mulheres jovens ou em doentes com elevado risco cirúrgico pode não ser uma opção. Além disso, métodos conservadores convencionais apresentam riscos inerentes, incluindo ineficácia e a possibilidade de recorrência. Estes factos suportam a necessidade de explorar novas abordagens conservadoras para o EC. A terapia fotodinâmica (PDT, do inglês Photodynamic Therapy) é um tratamento minimamente invasivo que pode ser considerado para a preservação da fertilidade. O nosso grupo de investigação desenvolveu recentemente umas novas clorinas muito promissoras que podem ser usadas como fotossensibilizadores em PDT. As clorinas fundidas com anel 4,5,6,7-tetra-hidropirazolo[1,5-a]piridina e as clorinas fundidas com anel 4,5,6,7-tetra-hidropirazolo[1,5-a]piridina de platina (II), Px1 e Px2, respetivamente, foram usadas neste estudo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da PDT com base em Px1 e Px2 (Px-PDT) como uma opção terapêutica conservadora e minimamente invasiva para o EC.Primeiramente, a resposta à PDT foi avaliada em linhas celulares do EC, ECC-1 e RL95-2. Para isso, foram realizados ensaios para avaliar a atividade metabólica, a viabilidade celular e os tipos de morte celular, o ciclo celular, as espécies reativas de oxigénio, o potencial de membrana mitocondrial e a internalização do fotossensibilizador. Numa segunda etapa, foi utilizado um modelo in vitro de células estaminais do cancro (CSC, do inglês Cancer Stem Cells). Através do protocolo de formação de esferas, a resposta das CSC à PDT foi avaliada utilizando os ensaios do Azul Tripano e do Alamar Blue, a área de projeção das esferas, assim como a internalização do fotossensibilizador.Os resultados principais mostraram que ambas as clorinas estudadas são ativas contra as linhas celulares do EC, ECC-1 e RL95-2, mas Px1 apresentou uma maior suscetibilidade aos fotossensibilizadores, apresentando valores de IC50 inferiores a 50 nM em relação à PDT. Px1 apresentou atividade fotodinâmica contra ambas as células tumorais do endométrio, com uma citotoxicidade muito baixa contra essas células na ausência de ativação de luz, o que torna esta clorina num fotossensibilizador para PDT. Além disso, nos ensaios com CSC foi observada uma diminuição da viabilidade, assim como uma diminuição notável da área de projeção de esferas.Em conclusão, ambos os sensibilizadores, Px1 e Px2, apresentaram eficácia como uma opção terapêutica para o EC com base nas novas clorinas, onde o Px1 claramente se destaca. Os resultados obtidos nesta dissertação abrem novos caminhos para a investigação da PDT com base em Px1 no EC não apenas in vitro, mas também in vivo. Outra perspetiva futura é a modulação das clorinas Px para terapêutica dirigida a CSC.

Endometrial cancer (EC) represents about 6% of female cancers, being the most frequent gynaecological malignancy in developed countries. Radical surgery is the primary treatment but in young women or patients with higher surgical risk may not be an option. Moreover, conventional conservative methods have inherent dangers, including inefficiency and the possibility of recurrence. These facts support the need to explore new conservative approaches for EC. Photodynamic therapy (PDT) is a minimally invasive treatment that can be considered for fertility-sparing. Our group recently developed novel very promising chlorins that can be used as photosensitizers in PDT. The 4,5,6,7-tetrahydropyrazolo[1,5-α] pyridine-fused chlorins and Pt (II) 4,5,6,7-tetrahydropyrazolo[1,5-α] pyridine-fused chlorin, Px1 and Px2, respectively, were used in this study. Thus, the aim of this study was to evaluate the effectiveness of Px1 and Px2 based PDT as a treatment option in EC based on new chlorins (Px-PDT) as a conservative and minimally invasive treatment to EC. First, PDT outcome was evaluated in ECC-1 and RL95-2 endometrial cancer cell lines. For this, assays to evaluate metabolic activity, cell viability and types of cell death, cell cycle, reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential, and photosensitizer’s internalization were performed. In a second step, an in vitro model of cancer stem cells was used. Through the sphere-forming protocol, CSC response to PDT was evaluated using the trypan blue and Alamar Blue assays, sphere´s projection area, as well as the photosensitizer’s internalization. The main results showed both studied chlorins are active against endometrial cancer cell lines ECC-1 and RL95-2, but Px1 has shown greater PS susceptibility, showing IC50 values below 50 nM regarding photodynamic therapy. Px1 showed PDT activity against both endometrial cancer cells, with a very low cytotoxicity against these cells in the absence of light activation, which makes this chlorin a photosensitizer of choice for PDT. Moreover, in the CSC assays was observed a decrease of viability , as well as a remarkleble decrease of sphere´s projection area. In conclusion, both Px1 and Px2 sensitizers presented effectiveness as a treatment option in EC based on new chlorins (Px-PDT), where Px1 clearly stands out. The results obtainesd in this dissertation open new avenues for the investigation of Px1 based PDT in endometrial cancer not only in vitro but also in vivo. Another future perspective is the modulation of Px chlorins for targeting CSC.