Development of a novel polymeric nanocarrier to mediate gene therapy for Hepatocellular Carcinoma

Abstract

Over the past decades, cancer became one of the major health problems worldwide. Among the most common types of cancers is liver cancer, which includes hepatocellular carcinoma. Hepatocellular carcinoma is the fourth leading cause of cancer-related death, and its incidence has been growing. The currently available treatment options are poorly effective and severely restricted when the disease is advanced. In these cases, systemic chemotherapy is usually applied. However, it is always accompanied by undesired side effects and a high rate of tumor recurrence. Therefore, it is necessary to develop new strategies, able to overcome these limitations.Gene therapy has been widely studied and has been demonstrating promising results for the treatment of several diseases, including cancer. It consists of the delivery of genetic material to the target cells, inducing a tumor suppressive effect. Even though viral gene delivery systems are most commonly used in the clinical field, non-viral gene delivery systems arise as safer systems and have been widely studied and engineered. Among the various non-viral gene delivery systems, polymeric nanoparticles stand out due to their biocompatibility and versatility. Besides, the techniques used to produce these systems allow a precise control of nanocarriers characteristics and modification of their surface in order to achieve the desired features. Polymeric nanoparticles include, among others, polymeric micelles and polyplexes, that could be synthesized from glycopolymers. These synthetic polymers contain carbohydrate groups in their structure, which promote targeting. Accordingly, glycopolymers containing the monomer LAMA (2-lactobionamidoethyl methacrylate), which has a galactose residue in its structure, were used to produce polymeric micelles and polyplexes. pLAMA is able to bind to the asialoglycoprotein receptor, overexpressed on the surface of HCC cells. Therefore, the main purpose of this work was to develop a polymer-based nanosystem capable of effectively and specifically deliver genetic material into HCC cells.Taking this into account, initially, polymeric micelles were produced using amphiphilic glycopolymers, PAMA103-co-PLAMA19-b-PDEAEMA63 and PAMA50-co-PLAMA10-b-PDEAEMA16. These nanosystems were extensively characterized, presenting a size around 70 nm, and were able to condense and protect genetic material. However, the results obtained after transfection of HepG2 cells with the polymeric micelles showed high levels of toxicity and low levels of biological activity. Additionally, the potential of the polymeric nanoparticles for drug delivery was evaluated. PAMA50-co-PLAMA10-b-PDEAEMA16-based micelles were loaded with sorafenib, a first-line drug approved for HCC treatment, and the values obtained for loading efficiency and loading capacity was 15 and 4 %, respectively, which are above what has been reported in the literature. However, these micelles resulted in high levels of toxicity in HepG2 cells and, for that reason, another approach was evaluated. The alternative consisted of the production of polyplexes using the polymer PAMA73-co-PLAMA21. These nanosystems presented a size around 150 nm and, overall, were able to condense and protect genetic material, maintaining their stability along time. The polyplexes were produced at different N/P charge ratios and resulted in great levels of transgene expression in the different hepatocarcinoma cell lines used. Transfection efficiency of these polyplexes prepared at 40/1 N/P charge ratio was evaluated by flow cytometry, showing an increased percentage of transfected cells comparing to the commercial control, PEI, which was confirmed by fluorescence microscopy. Additionally, the specificity of the developed polyplexes towards the asialoglycoprotein receptor was demonstrated by a competition assay, using the natural ligand for this receptor, asialofetuin. The obtained results were confirmed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cellular uptake and intracellular distribution of the polyplexes were assessed by confocal microscopy, showing that some polyplexes were colocalized with endosomes. As an attempt to promote endosomal escape, a microtubule-stabilizing agent, docetaxel, was used, resulting in a substantial increase of transfection activity. At last, to evaluate the potential of the PAMA73-co-PLAMA21-based polyplexes to mediate an antitumor strategy, a preliminary test was performed, using polyplexes prepared with the therapeutic plasmids encoding p53 or PTEN, having been observed a significant reduction on the cell viability.

Ao longo das últimas décadas, o cancro tornou-se um dos maiores problemas de saúde a nível mundial. Entre os tipos de cancro mais comuns encontra-se o cancro do fígado, que inclui o Carcinoma Hepatocelular. Este carcinoma é a quarta causa de morte por cancro e a sua incidência tem vindo a aumentar. As opções de tratamento disponíveis são pouco eficazes, além de serem bastantes restritas em casos de doença avançada. Nestes casos, geralmente, é aplicada a quimioterapia. No entanto, este tipo de terapia é sempre acompanhada por efeitos secundários indesejados. Deste modo, tornou-se necessário desenvolver novas estratégias, capazes de ultrapassar estas limitações.A terapia génica tem sido intensivamente estudada e tem demonstrado resultados promissores no tratamento de diversas doenças, incluindo o cancro. Esta consiste na entrega de material genético a células alvo, com o intuito de induzir um efeito de supressão tumoral. Apesar dos sistemas de transporte virais serem mais aplicados na clínica, os sistemas de transporte não-virais têm-se destacado por serem mais seguros. De entre os vários sistemas de transporte não-virais, as nanopartículas poliméricas destacam-se devido à sua biocompatibilidade e versatilidade. Para além disso, as técnicas usadas para produzir estes sistemas permitem controlar as características finais das nanopartículas e modificar a sua superfície de acordo com a finalidade ou células alvo. As nanopartículas poliméricas incluem, entre outros, micelas poliméricas e poliplexos, que podem ser desenvolvidos a partir de glicopolímeros. Estes são polímeros sintéticos que contêm grupos carboidrato na sua composição, capazes de promover o direcionamento. Assim, glicopolímeros que contêm o monómero LAMA (2-lactobionamidoetil metacrilato), que possui um resíduo de galactose na sua estrutura, foram usados para produzir micelas poliméricas e poliplexos. Este monómero apresenta a capacidade de se ligar ao recetor das asialoglicoproteínas, que se encontra sobreexpresso na superfície das células de HCC. Assim, o principal objetivo desta dissertação consistiu no desenvolvimento de um nanossistema de base polimérica capaz de entregar eficaz e especificamente material genético às células de HCC.Tendo isto em conta, inicialmente, foram produzidas micelas poliméricas usando glicopolímeros anfifílicos, PAMA103-co-PLAMA19-b-PDEAEMA63 e PAMA50-co-PLAMA10-b-PDEAEMA16. Estes nanossistemas foram caracterizados, apresentando um tamanho de aproximadamente 70 nm, e capacidade para condensar e proteger o material genético. Contudo, os resultados obtidos após transfeção de células HepG2 mostraram níveis elevados de toxicidade e baixos níveis de atividade biológica. Adicionalmente, foi avaliado o potencial destas micelas poliméricas para entrega de fármacos. Micelas produzidas com o polímero PAMA50-co-PLAMA10-b-PDEAEMA16 foram carregadas com sorafenib, um fármaco de primeira linha aprovado para o tratamento de HCC. Os valores obtidos para a eficiência de encapsulação e capacidade de carga foram de 15 e 4 %, respetivamente, encontrando-se acima do que está reportado na literatura para este tipo de nanosistemas. No entanto, estas micelas resultaram em níveis elevados de toxicidade nas células HepG2 e, como tal, foi avaliada outra abordagem.Essa nova abordagem consistiu na produção de poliplexos usando o polímero PAMA73-co-PLAMA21. Este nanossistemas apresentam um tamanho de cerca de 150 nm e, de um modo geral, apresentam capacidade para condensar e proteger o material genético, mantendo a sua estabilidade ao longo do tempo. Os poliplexos foram produzidos em diferentes rácios de carga N/P e resultaram em níveis notáveis de expressão do transgene nas várias linhas celulares de carcinoma hepatocelular utilizadas. A eficiência de transfeção destes poliplexos, preparados no rácio de carga (+/-) 40/1, foi avaliada por citometria de fluxo, demonstrando uma percentagem elevada de células transfetadas quando comparado com o controlo comercial, PEI, o que foi confirmado através de microscopia de fluorescência. A especificidade destes nanossistemas para com o recetor das asiologlicoproteínas foi comprovada através de um ensaio de competição, usando o ligando natural deste recetor, a asialofetuína. A internalização celular e distribuição intracelular dos poliplexos foram avaliadas por microscopia confocal, demonstrando que alguns dos poliplexos se encontravam nos endossomas. Como tal, com o intuito de promover o escape endossomal, foi usado um fármaco estabilizador de microtúbulos, o docetaxel, que resultou num aumento substancial da sua capacidade de transfeção. Por último, para avaliar o potencial dos nanossistemas desenvolvidos para mediar uma estratégia antitumoral, foi realizado um ensaio preliminar, usando os poliplexos preparados com plasmídeos terapêuticos que codificam os supressores tumorais p53 ou PTEN, tendo-se verificado uma redução significativa da viabilidade celular.