Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/97928
Title: Characterizing the diversity of the extracellular region of Gram-negative bacteria outer-membrane channel-tunnels
Other Titles: Caracterização da diversidade da região extracelular de canais-túnel da membrana externa de bactérias Gram-negativas
Authors: Simões, André Faria Pita
Orientador: Pires, Paula Cristina Veríssimo
Pires, Ricardo Simão Vieira
Keywords: canal-túnel TolC; Gram-negativas; sistemas de efluxo; regiões de loops extracelulares; TolC channel-tunnel; Gram-negatives; efflux system; extracellular loop regions
Issue Date: 23-Nov-2021
Project: info:eu-repo/grantAgreement/FCT/9471 - RIDTI/PTDC/BTM-SAL/30550/2017/PT 
Serial title, monograph or event: Characterizing the diversity of the extracellular region of Gram-negative bacteria outer-membrane channel-tunnels
Place of publication or event: Grupo de Biotecnologia Estrutural, UC-Biotech (CNC)
Abstract: TolC é um canal da membrana exterior presente num vasto número de bactérias Gram-negativas. Em conjunto com duas proteínas, um transportador da membrana interna AcrB e a uma peri-plasmática AcrA, responsável pela ligação das duas proteínas integrais, constituindo o sistema de efluxo AcrAB-TolC. O sistema pertence à superfamília resistance-nodulation-division (RND), que representa uma preocupação particular quando se trata de resistência antimicrobiana (AMR) em bactérias Gram-negativas. Este canal é o último e direto contato com o meio extracelular. A sua membrana externa β-barrel que abre para o espaço extracelular e expõe os pares de loops estruturais (L1 e L2) está pouco caraterizada, mas está, muito provavelmente, envolvida com a atividade de efluxo e permeabilidade. Tendo isto em consideração, o trabalho proposto assenta em duas tarefas. Tarefa-1 consiste na análise do tamanho e na variação da sua composição das regiões extracelulares de TolCs em bactérias Gram-negativas, como: E.coli, Pseudomonas spp., Campylobacter spp., Vibrio spp., Acinetobacter spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., and Shigella spp.. Tarefa-2 foi trabalhado o design, produção e caracterização de um canal TolC quimérico como uma nova plataforma de análise estrutural e funcional das regiões extracelulares do canal TolC.Na Tarefa-1, foram analisados aproximadamente 400 organismos provenientes de 8 strains Gram-negativas onde se procedeu à identificação do canal TolC homologo, com recurso à base de dados KEGG. A sequência e estrutura do TolC de E.coli (PDB ID:1TQQ) foi utilizado como referência ao longo do trabalho todo. Uma análise extensiva das sequências tipo TolC obtidas, usando ferramentas analíticas para sequências de proteínas (BLAST, CD-HIT) e de estrutura (Phyre2, mTM-align, PyMOL), permitiram uma detalhada caracterização e comparação das regiões extracelulares L1 e L2 dos canais TolC. Esta análise revelou essencialmente duas grandes tendências quando olhamos para os perfis de tamanho variáveis dos loops L1 e L2. Strains como E.coli, Pseudomonas spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., e Shigella spp. demonstraram um grau elevado de consistência do tamanho dos loops dentro da mesma strain (rácio do tamanho L1/L2 ~0,5-0,8), enquanto que Campylobacter spp., Vibrio spp., Acinetobacter spp., demonstram uma baixa consistência no tamanho dos loops com uma variação maior (rácio do tamanho L1/L2 ~0,5-1,8). Análise individual por grupo de L1 e L2, revelou uma tendência de compensação do tamanho com L1s mais pequenos a serem compensados com L2s maiores, e vice-versa, com pequenas exceções que se revelam apostas interessantes para estudos futuros. Este trabalho também se focou numa análise da composição das sequências proteicas de L1 e L2 que revelou, como esperado, maior conservação das sequências dentro das strains com maior consistência do tamanho dos loops. Outras tendências gerais relativas à variação nas sequências destes loops foram difíceis de identificar devido ao reduzido número de strains/organismos anotadas no KEGG.A Tarefa-2 consistiu no desenvolvimento de quimeras do canal tipo TolC sintéticas, baseadas na proteína TolC de E.coli bastante caracterizada (PDB ID: 1TQQ). A estratégia quimérica implicou a substituição/enxertia da região β-barrel integrada na membrana do canal TolC da E.coli pela região β-barrel de outra espécie, por exemplo Vibrio anguillarum. Foram produzidas e desenvolvidas com sucesso duas quimeras E.coli/Vibrio: uma versão truncada (1-450 aa) e outra completa (1-493 aa). Ensaios de expressão bacteriana revelaram uma expressão ótima para ambas as versões quiméricas na expressão da E.coli em células C41. As análises de SDS-PAGE e Western blot corroboraram a expressão correta e a solubilização do produto recombinante.Este trabalho é uma sólida contribuição para a elucidação contínua da função e estrutura dos canais TolC. De facto, estes resultados desvendaram detalhes inovadores que não tinham sido descritos anteriormente na literatura acerca dos loops extracelulares TolC L1 e L2, facultando novas hipóteses e possibilidades para estudos futuros. Consequentemente, a produção bem-sucedida das quimeras recombinantes de TolC abre novos caminhos para estudos de efluxo in vivo para a caracterização detalhada do impacto funcional nos loops L1 e L2. Por fim, os resultados sustentam o foco principal do laboratório de acolhimento, nomeadamente para o desenvolvimento de novas estratégias com anticorpos contra diferentes TolCs de Gram-negativas e, portanto, para o estudo do bloqueio do efluxo de antibióticos com vista a aplicações terapêuticas.
TolC is an outer-membrane protein channel-tunnel spread among a vast number of Gram-negative bacteria. Together with two other proteins, an inner membrane AcrB transporter and the periplasmatic AcrA which connects the two integral proteins, they constitute the AcrAB-TolC efflux system. The system belongs to the resistance-nodulation-division (RND) superfamily, which represents a particular concern when it comes to antimicrobial resistance (AMR) across Gram-negative bacteria. It is responsible for the extrusion of antibiotics and other toxic compounds, thus, having a direct implication in bacterial resistance. The TolC channel-tunnel protein is the direct and ultimate interface with the extracellular environment. Its outer-membrane embedded beta-barrel opens to the extracellular face, exposing pairs of structural loops (L1 and L2) poorly characterized, but very likely related with the channel efflux activity and permeability.Taking this in consideration, the proposed work focused on two tasks. Task-1 consisted of the analysis of the length and composition variation of TolC’s extracellular region in selected Gram-negative strains, namely from the species: E.coli, Pseudomonas spp., Campylobacter spp., Vibrio spp., Acinetobacter spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., and Shigella spp. In Task-2 we worked on the design, production, and characterization of TolC channel-tunnel chimeras as novel platforms for structural and functional analysis of TolC’s extracellular region. In Task-1 ~400 strains from 8 different Gram-negative species were explored to identify TolC-like channel-tunnel homologs, making use of the KEGG database. E.coli TolC protein sequence and structure were used as reference across the whole work (PDB ID: 1TQQ). Extensive bioinformatic analysis and processing of the obtained TolC-like sequences, namely using protein sequence (e.g. BLAST, CD-HIT) and structure (e.g. Phyre2, mTM-align, Pymol) analytical tools, enabled a detailed characterization and comparison of the extracellular L1 and L2 loop regions of TolC channel-tunnels across the group of selected strains.The analysis revealed essentially two large tendencies when looking to L1 and L2 loop size variation profiles. Group species such as E.coli, Pseudomonas spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., and Shigella spp., showed a higher degree of loop size consistency within each group (L1/L2 size ratio ~0,5-0.8), while Campylobacter spp., Vibrio spp., Acinetobacter spp., showed low consistency of loop sizes with a broader range of variation (L1/L2 size ratio ~0,5-1.8). Individual analysis of L1 and L2 per group, revealed a tendency for size compensation with smaller size L1s being compensated by larger size L2s and vice-versa, with a few exceptions revealing interesting outliers for future studies. The work also focused on the analysis of L1 and L2 protein sequence compositions that revealed, as expected, higher sequence conservation within the group species with high degree of loop size consistency. Other general tendencies concerning loop sequence variation were difficult to identify given the rather small number of annotated KEGG strains/organisms.Task-2 consisted in the development of synthetic TolC-like channel-tunnel chimeras based on the well characterized E.coli TolC channel protein (PDB ID: 1TQQ). The chimeric strategy implied the substitution/grafting of the membrane embedded β-barrel region of the E.coli TolC channel by the one of another specie i.e. Vibrio anguillarum. Two E.coli/Vibrio chimeras were successfully developed and recombinantly produced: a truncated (1-450 aa) and a full-length (1-493 aa) version. Bacterial expression assays revealed optimal expression of both chimeric versions in E.coli C41 expression strains, with SDS-PAGE and Western blot analysis corroborating proper expression and detergent solubilization of the recombinant product.This work is a solid contribution for the continuous elucidation of TolC channel-tunnels structure and function. Indeed, the results reveal novel details not previously described in the literature, about TolC’s L1 and L2 extracellular loops, enabling new hypothesis and possibilities for future studies. Consistently, the successful production of recombinant TolC chimeras opens the door to subsequent in vivo efflux assays for detailed characterization of L1 and L2 functional impact. Ultimately, the data supports a major focus of the host lab, namely the development of novel antibody targeting strategies against different Gram-negative TolCs and thus antibiotic efflux blockade studies towards therapeutic applications.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/97928
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:UC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat Login
Dissertação Final - André Faria Pita Simões.pdf5.81 MBAdobe PDFEmbargo Access    Request a copy
Show full item record

Page view(s)

21
checked on Aug 19, 2022

Download(s)

3
checked on Aug 19, 2022

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons