O potencial terapêutico de sirolimus e metformina na leucemia linfoblástica aguda em idade pediátrica

Abstract

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia mais comum da infância e caracteriza-se por disfunção na proliferação e/ou diferenciação de linfoblastos. Os esquemas terapêuticos atuais permitem alcançar taxas de sobrevivência aos 5 anos de cerca de 90%. Contudo, as recaídas ocorrem em cerca de 15% dos casos, constituindo uma das principais causas de mortalidade infantil por cancro. A patogénese desta doença é complexa e envolve a via de sinalização do mTOR, cuja ativação constitutiva promove o crescimento celular, sobrevivência e inibição da autofagia. Esta via pode ser inibida diretamente por inibidores do mTORC1 ou indiretamente através da ativação da AMPK.Este estudo pretende avaliar o potencial terapêutico do sirolimus (SIR), um inibidor do mTORC1, e da metformina (MET), um ativador do AMPK, em dois modelos in vitro de LLA.As linhas celulares 697 (LLA de células B) e CEM (LLA de células T) foram incubadas com SIR e MET, em monoterapia. A atividade metabólica foi analisada com o teste da resazurina. A morte celular foi avaliada por citometria de fluxo (CF), usando a dupla marcação com anexina V e 7-amino-actinomicina D, e por microscopia óptica, após coloração de May-Grünwald-Giemsa. Por fim, analisou-se o ciclo celular por CF, recorrendo a iodeto de propídeo/RNase, e a expressão dos genes marcadores da autofagia BECN1, SQSTM1 e MAP1LC3B por PCR em tempo real.Tanto o SIR como a MET reduziram a atividade metabólica das células 697 (IC50 de 4,184 μM e 15,39 mM, respetivamente) e CEM (IC50 de 0,897 μM e 14,22 mM, respetivamente) de forma dependente da dose, do tempo e da linha celular. As células CEM apresentaram maior sensibilidade a ambos os compostos. A análise da morte celular por CF demostrou que ambos os fármacos induzem apoptose, estando em concordância com a análise morfológica, onde se observou células com características apoptóticas, e com a análise do ciclo celular no qual se observou um pico pré-G0/G1. A análise do ciclo celular demonstrou que ambos os fármacos induzem efeito citostático nas células 697 e que apenas o SIR produz este efeito nas células CEM. Além disso, observou-se que ambos os compostos induzem aumento da expressão de genes da autofagia (SIR: SQSTM1 e MAP1LC3B; MET: SQSTM1, BECN1 e MAP1LC3B).Os nossos resultados sugerem que o SIR e a MET poderão ter utilidade na terapêutica da LLA, podendo os seus efeitos citotóxicos ser mediados por ativação da autofagia. No entanto, são necessários mais estudos para esclarecer a importância destes fármacos no tratamento da LLA, bem como o papel da autofagia na morte celular induzida pelo SIR e MET.

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common neoplasia in childhood characterized by a dysfunction in proliferation and/or differentiation of immature lymphoid cells. Current therapeutic regimens allow 5-year overall survival rates approaching 90%. However, relapses occur in 15% of cases, constituting a major cause of child cancer mortality. The pathogenesis of this disease is complex and involves the mTOR signaling pathway, whose constitutive activation promotes cell growth, survival and autophagy downregulation. This signaling pathway can be inhibited directly by mTORC1 inhibitors or indirectly by activation of AMPK.This study aimed to assess the potential therapeutic of sirolimus (SIR), an mTORC1 inhibitor, and metformin (MET), an AMPK activator, in two in vitro ALL models.697 (B-cell ALL) and CEM (T-cell ALL) cell lines were incubated with increasing concentrations of SIR and MET in monotherapy and we assessed metabolic activity with the resazurin assay. Then, we studied cell death by flow cytometry (FC), using annexin V and 7-amino-actinomycin D double labeling, and by light microscopy after May-Grünwald-Giemsa staining. Finally, we analyzed cell cycle by flux cytometry, using propidium iodide/RNase. The expression of genes of autophagy (BECN1, SQSTM1 and MAP1LC3B) was assessed by real time polymerase chain reaction.SIR and MET reduce the metabolic activity of 697 (IC50 of 4,184 μM and 15,39 mM, respectively) and CEM (IC50 of 0,897 μM and 14,22 mM, respectively) cells in a dose, time and cell line dependent manner. The CEM cells showed higher sensitivity to both compounds. Analysis of cell death by flux cytometry showed that both drugs produce apoptotic cell death, in agreement with morphological analysis, where we observed cells with apoptotic characteristics, and with cell cycle analysis, where a pre-peak G0/G1 was observed. Cell cycle analysis showed that SIR and MET had a cytostatic effect on 697 cells and SIR had also a cytostatic effect on CEM, with increasing percentage of cells in G0/G1 phase. Moreover, both drugs increased the expression of autophagy genes (SIR: SQSTM1 and MAP1LC3B; MET: SQSTM1, BECN1 and MAP1LC3B).Our results suggest that SIR and MET may be useful in the treatment of ALL, and their cytotoxic effects may be mediated by autophagy activation. However, further studies are needed to clarify the importance of these drugs in the treatment of ALL, as well as the role of autophagy in cell death induced by SIR and MET.