Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/96422
Title: DNA methylation as an age predictor in living and deceased individuals
Other Titles: Metilação de DNA como um preditor de idade em indivíduos vivos e mortos
Authors: Dias, Maria Helena Correia
Orientador: Manco, Licínio Manuel Mendes
Cunha, Eugénia Maria Guedes Pinto Antunes da
Gonçalves, Francisco Manuel Andrade Corte-Real
Keywords: Forensic Sciences; Ciências Forenses; Age estimation; DNA methylation (DNAm); Age prediction models (APMs); Sanger sequencing; SNaPshot; Estimativa da idade; Metilação de DNA (DNAm); Modelos de predição de idade (APMs); Sequencição de Sanger; SNaPshot
Issue Date: 12-Jul-2021
Project: SFRH/BD/117022/2016 
Place of publication or event: Coimbra
Abstract: Age estimation is very useful in forensic sciences for identification purposes. In recent years, DNA methylation (DNAm) has arisen as a promising tool for age prediction. In consequence, age prediction models (APMs) have been developed using many age-correlated genes, different methodologies and several biological samples. The main aim of this study was to develop APMs based on previously known age-associated genes, including ELOVL2, EDARADD, FHL2, PDE4C, C1orf132, KLF14 and TRIM59, using different tissues with forensic interest. In addition, we investigated putative differences in DNAm between blood from living and deceased individuals and according to increasing age, sex, ancestry and postmortem interval (PMI). DNAm levels were evaluated in 267 biological samples (including blood, teeth, bones and buccal swabs) from living and deceased Portuguese individuals through bisulfite polymerase chain reaction (PCR) Sanger sequencing and multiplex SNaPshot methodologies. Additionally, nine skeletonized individuals were tested for DNAm analysis. Linear regression models were used to analyze relationships between DNAm and chronological age. Promising results were obtained in our study. Using SNaPshot, the most accurate APM built in 56 blood samples from living individuals included three CpGs (in genes ELOVL2, FHL2 and C1orf132), showing a Mean Absolute Deviation (MAD) between predicted and chronological ages of 4.25 years; in 59 deceased individuals the most accurate APM was built with four CpGs (in genes ELOVL2, FHL2, C1orf132 and TRIM59) with a MAD of 5.36 years. The Sanger sequencing allowed to build accurate APMs in 53 blood samples from living individuals (MAD = 5.35 years), with the best CpGs at ELOVL2, FHL2, EDARADD and PDE4C, and in 47 blood samples from deceased individuals (MAD = 6.08 years), with the best CpGs at ELOVL2, FHL2, C1orf132, EDARADD and PDE4C. In the combined set of blood samples from living and deceased individuals, the best APMs were built with CpGs at ELOVL2, FHL2, C1orf132 and TRIM59 (MAD = 4.97 years) using SNaPshot, and with CpGs at genes ELOVL2, FHL2, EDARADD and PDE4C (MAD = 6.21 years) through Sanger sequencing. Moreover, our study highlighted the most promising APM in 29 bones from autopsies, using Sanger sequencing, built with six CpGs at ELOVL2, EDARADD and C1orf132, and revealing a MAD of 2.56 years. Through SNaPshot, the most accurate APM (MAD = 7.18 years) in 31 bones from autopsies was built with two CpGs in genes FHL2 and KLF14. Potential useful APMs were developed in the other tissues, including: in 21 bones from Bodies Donated to Science with two CpGs in genes FHL2 and PDE4C (MAD = 4.67 years) using Sanger sequencing; in buccal swabs with TRIM59 CpG using SNaPshot in 35 samples (MAD = 6.73 years) and with two CpGs at ELOVL2 using Sanger sequencing in 23 samples (MAD = 8.32 years); in teeth with two CpGs at ELOVL2 and KLF14 (MAD = 7.07 years) in 23 samples using SNaPshot. Additionally, we developed several multi-tissue APMs, obtaining the best accuracy (MAD = 6.49 years) in a group with bones from autopsies and blood and teeth from living and deceased individuals using SNaPshot (with CpGs at ELOVL2, KLF14 and C1orf132). In this same group, Sanger sequencing allowed the development of an APM with nine CpGs at genes ELOVL2, EDARADD, PDE4C and FHL2 and a similar value of MAD (6.42 years). Ours results revealed that the model accuracy depends on the chronological age of individuals, in concordance with previous studies, and that there is no influence of sex and PMI in DNAm levels. The possibility that age markers might be population specific and that postmortem changes can alter the methylation status among specific loci was also suggested by our data. DNAm changes were observed due to treatment of the body after death. In regards to bones from skeletonized individuals, the amount of extracted DNA was not sufficient for a subsequent successful DNAm age estimation. Moreover, it has been observed that the APMs developed in blood from living individuals cannot be applied to deceased individuals with a similar MAD value. However, the APMs developed in blood from deceased individuals when applied to living individuals revealed a similar MAD. This can be a relevant issue in future application of the developed APMs in forensic contexts. In conclusion, our study is a relevant contribution for DNAm age research, showing the usefulness of both bisulfite PCR sequencing and multiplex SNaPshot methodologies for forensic analysis in several tissue types. The herein developed APMs seem to be informative and could have potential applications in different forensic contexts. Despite of this, our study could be improved with the use of larger sample sets, with higher statistical power, and being more representative of age range and different tissue types.
A estimativa da idade é muito útil em Ciências Forenses para fins de identificação. Nos últimos anos, a metilação de DNA (DNAm) surgiu como uma ferramenta promissora para predição da idade. Em consequência, vários modelos de predição de idade (APMs) têm sido desenvolvidos, recorrendo a genes correlacionados com a idade, diferentes metodologias e várias amostras biológicas. O principal objetivo deste estudo foi desenvolver APMs usando genes previamente associados com a idade, incluindo ELOVL2, EDARADD, FHL2, PDE4C, C1orf132, KLF14 e TRIM59, e diferentes tecidos biológicos com interesse forense. Além disso, investigámos possíveis diferenças nos níveis de DNAm entre sangue de indivíduos vivos e mortos, e de acordo com as categorias etárias, sexo, ancestralidade e intervalo postmortem (PMI). Os níveis de DNAm foram avaliados em 267 amostras biológicas (incluindo sangue, dentes, ossos e esfregaços bucais) de indivíduos Portugueses, vivos e mortos, através das metodologias de sequenciação de Sanger e SNaPshot, após conversão do DNA por bissulfito. Foram ainda testados 9 indivíduos esqueletizados para análise de DNAm. A associação entre os níveis de DNAm e a idade cronológica foi analisada com modelos de regressão linear. Foram obtidos alguns resultados promissores, entre os quais se destacam os melhores APMs, obtidos por SNaPshot, em 56 amostras de sangue de indivíduos vivos e que incluiu 3 CpGs dos genes ELOVL2, FHL2 e C1orf132, com uma média de desvio absoluto (MAD) entre as idades prevista e cronológica de 4,25 anos, e o melhor APM em 59 amostras de sangue de indivíduos mortos, construído com 4 CpGs dos genes ELOVL2, FHL2, C1orf132 e TRIM59 e uma MAD de 5,36 anos. Por sua vez, por sequenciação, os melhores APMs foram obtidos em 53 amostras de sangue de indivíduos vivos com o melhor CpG de cada um dos genes ELOVL2, FHL2, EDARADD e PDE4C (MAD = 5,35 anos), e em 47 amostras de sangue de indivíduos mortos com o melhor CpG de cada um dos genes ELOVL2, FHL2, C1orf132, EDARADD e PDE4C (MAD = 6,08 anos). No conjunto de sangue de vivos e mortos, os melhores APMs foram obtidos com os CpGs dos genes ELOVL2, FHL2, C1orf132 e TRIM59 (MAD = 4,97 anos) por SNaPShot, e com 4 CpGs dos genes ELOVL2, FHL2, EDARADD e PDE4C (MAD = 6,21 anos) por sequenciação. O nosso estudo destacou um dos APMs mais promissores em 29 ossos de autópsias usando sequenciação, construído com 6 CpGs dos genes ELOVL2, EDARADD e C1orf132, e uma MAD de 2,56 anos. Através de SNaPshot, o melhor APM foi construído em 31 ossos de autópsias com 2 CpGs dos genes FHL2 e KLF14 (MAD = 7,18 anos). Outros APMs foram desenvolvidos nos restantes tecidos, incluindo: em 21 ossos dos Corpos Doados à Ciência, com 2 CpGs dos genes FHL2 e PDE4C (MAD = 4,67 anos), através da sequenciação; em esfregaços bucais, com o CpG do gene TRIM59 (MAD = 6,73 anos) em 53 amostras por SNAPshot, e com 2 CpGs do gene ELOVL2 (MAD = 8,32 anos) em 23 amostras por sequenciação; em dentes, com 2 CpGs dos genes ELOVL2 e KLF14 (MAD = 7,07 anos) em 23 amostras, por SNaPshot. Também desenvolvemos APMs em conjuntos de vários tecidos, tendo-se obtido a melhor precisão (MAD = 6,49 anos) para o APM construído no grupo com ossos de autópsias e sangue e dentes de indivíduos vivos e mortos, por SNaPshot (com 3 CpGs dos genes ELOVL2, KLF14 e C1orf132). No mesmo grupo, por sequenciação, desenvolveu-se um APM com 9 CpGs dos genes ELOVL2, EDARADD, PDE4C e FHL2 e uma MAD de 6,42 anos. Os nossos resultados revelaram que a precisão dos APMs depende da idade cronológica dos indivíduos, em concordância com estudos prévios, e que não há influência do sexo e do PMI nos níveis de DNAm. A possibilidade dos marcadores de idade serem específicos para as populações e de modificações postmortem poderem alterar o estado de metilação de certos genes foi também sugerida pelos nossos dados. Foram ainda observadas alterações nos níveis de DNAm devido ao tratamento do corpo após a morte. Em relação aos ossos de indivíduos esqueletizados, a quantidade de DNA extraído não foi suficiente para estimar a idade através de DNAm. Foi ainda observado que os APMs desenvolvidos em sangue de vivos não podem ser aplicados a mortos com valores de MAD semelhantes. Mas, por sua vez, os APMs desenvolvidos em indivíduos mortos quando aplicados a vivos revelaram um valor de MAD similar. Isto pode ser importante na futura aplicação dos APMs em contextos forenses. Em conclusão, o nosso estudo é uma contribuição relevante para a investigação da estimativa da idade através de DNAm, mostrando que as duas metodologias, sequenciação Sanger e SNaPShot, podem ser úteis para análises forenses em vários tecidos. Os APMs desenvolvidos parecem ser informativos e podem ter potencial aplicação em diferentes contextos forenses. Apesar disso, o nosso estudo poderia ser melhorado com o uso de um maior número de amostras, com maior poder estatístico, e maior representatividade quer de categorias etárias quer de diferentes tecidos.
Description: Tese no âmbito do Doutoramento em Antropologia, Antropologia Forense, orientada pelos Professores Doutores Licínio Manuel Mendes Manco, Eugénia Maria Guedes Pinto Antunes da Cunha, Francisco Manuel Andrade Corte Real Gonçalves e apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/96422
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento
UC - Teses de Doutoramento

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