Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/96420
Title: The role of danger signals in allergic diseases to low molecular weight chemicals
Authors: Ferreira, Isabel Cristina do Vale
Orientador: Lopes, Maria Celeste
Rosete, Maria Teresa de Teixeira Cruz
Neves, Bruno Miguel Rodrigues das
Issue Date: 10-Sep-2021
Project: SFRH/BD/110717/2015 
Abstract: Allergic diseases resulting from exposure to chemicals represent important occupational health problems, as their prevalence is increasing worldwide, with high levels of morbidity, and significant socio-economic impact. Although they can take a variety of forms, the most relevant are allergic contact dermatitis (ACD) resulting from skin sensitization and asthma and occupational rhinitis caused by sensitization of the respiratory tract. ACD affects about 20% of the European population while occupation asthma accounts for 10-25% of total asthma cases. Although thousands of chemicals have been implicated as contact allergens, only about less than 80 chemicals have been confirmed as respiratory allergens. As expected, the nature of cellular and molecular events leading to skin sensitization is rather well characterized compared to respiratory sensitization (RS). It is well established that both diseases depend on the chemical’s ability to covalent modify proteins to trigger sensitization. Concomitantly there’s also a release of danger signals by epithelial cells that promote dendritic cell (DC) recruitment, activation and maturation, which in turn will prime naïve T cells. However, the knowledge concerning how, and to what degree, the release of danger signals contributes to the differential priming of T cells observed in ACD (Th1 response) and RS (Th2), remains limited. To fill these gaps and move ahead the state of the art, this work aimed to shed light on the differential danger signals elicited by respiratory and skin allergens, using THP-1 cells as a surrogate for DC. In a first approach, the nature and kinetics of reactive oxygen species (ROS) production, elicited by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) and trimellitic anhydride chloride (TMAC), two golden standards of skin and chemical respiratory allergy, respectively, were evaluated. To track this goal, time course modifications of ROS production and cellular antioxidant defenses were addressed as well as the modulation of MAPKs signaling pathways and transcription of pathophysiological relevant genes in THP-1 cells. The thiol-reactive sensitizer DNFB was shown to directly react with cytoplasmic glutathione (GSH) causing its rapid and marked depletion which resulted in a general increase in ROS accumulation. In turn, TMAC, which preferentially reacts with amine groups, induced a delayed GSH depletion as a consequence of increased mitochondrial ROS production. These divergences in ROS production seemed to be correlated with the different extension of intracellular signaling pathways activation and, by consequence, with distinct transcription kinetics of genes such as HMOX and NQO1. Together, these data suggest that skin sensitizers-induced Th1 polarization may result from a sustained transcription of pro-inflammatory cytokines and co-stimulatory molecules in DCs, while Th2 polarization is characterized by a modest and transitory transcription. In a second approach, and since several danger signals are also described as inflammasome activators, the mechanisms behind sensitizer-induced inflammasome activation were characterized. Inflammasome activation has been recognized as critical for successful sensitization and activation of T cell responses. Inflammasomes are cytoplasmic caspase-1-activating protein complexes that promote maturation and secretion of the proinflammatory cytokines interleukin (IL)-1ß and IL-18. The most intensively studied inflammasome, (NOD)-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome, can be activated by a plethora of trigger such as potassium efflux, lysosomal rupture, ROS production, and mitochondrial disruption. Although lysosomal rupture is often associated with crystalline and particulate materials, herein we demonstrate that the skin sensitizer DNFB activates NLRP3 inflammasome through lysosomal destabilization and subsequent cathepsin leakage. Inhibition of cathepsin activity has shown to impair NLRP3 activation and the DNFB-induced expression of the maturation marker CD86, thus disclosing an innate immune mechanism crucial for the development of allergic contact sensitization to LMW chemicals. Furthermore, this new mechanism of inflammasome was observed with other thiol-reactive skin sensitizers, suggesting that this mechanism is shared by sensitizers with high thiol reactivity. A new method to immunoprecipitate DNFB-haptenated proteins was also proposed has a tool not only to comprehend how DNFB induces lysosomal destabilization but also to identify possible therapeutics targets for ACD. Altogether these results generate important insights regarding danger signals differential involvement in ACD and RS, which may be crucial for Th1 or Th2 cell response development. Furthermore, we describe for the first time a mechanism by which non-particulate structures or chemicals without detergent‐like effects, trigger the assembly of NLRP3 inflammasome.
As alergias decorrentes da exposição a produtos químicos têm vindo a aumentar a nível mundial, com elevados índices de morbidade e um impacto socioeconómico significativo. Entre as alergias ocupacionais mais comuns, são de destacar a dermatite de contacto alérgica (ACD), resultante da sensibilização da pele, e a asma e rinite ocupacionais, causadas pela sensibilização do trato respiratório. A ACD afeta cerca de 20% da população europeia, enquanto a asma ocupacional é responsável por 10-25% do total de casos de asma. A fisiopatologia da ACD é consideravelmente mais estudada que a sensibilização respiratória, sendo que atualmente milhares de compostos foram identificados como alergénios cutâneos enquanto apenas 80 foram identificados como alergénios respiratórios. Não obstante, é consensual dentro da comunidade científica que ambas as patologias dependem da capacidade dos compostos modificarem proteínas celulares através da formação de ligações covalentes com as mesmas, processo necessário para promoverem uma reação imunológica. Concomitantemente, há a liberação de mediadores moleculares responsáveis pelo recrutamento, diferenciação e maturação das células dendríticas (DC), as quais migram para os nódulos linfáticos onde ativam linfócitos T. Apesar da importância dos mediadores moleculares em ambas as respostas imunológicas, o conhecimento relativo a como e em que grau a sua libertação contribui para o priming e polarização diferencial dos linfócitos T em Th1 e Th2, característicos da ACD e sensibilização respiratória, respetivamente, permanece limitado. Com o objetivo de preencher as lacunas existentes e avançar no estado da arte, este trabalho teve como objetivo identificar os diferentes mediadores moleculares diferencialmente modulados por alergénios respiratórios e cutâneos, usando células THP-1 como modelo de células dendríticas. Numa primeira abordagem, foram avaliadas a natureza e a cinética da produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) induzida por 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB) e cloreto de anidrido trimelítico (TMAC), compostos referência para a ACD e a sensibilização respiratória, respetivamente. Com este objetivo, foram avaliados os níveis de ROS e defesas antioxidantes, bem como as vias de sinalização MAPKs e a transcrição de genes envolvidos na resposta antioxidante. Os resultados obtidos demonstraram que o alergénio cutâneo DNFB, que reage preferencialmente com grupos tiol, conduz a uma rápida depleção da glutationa citoplasmática, despoletando um aumento nos níveis de ROS. Por sua vez, o alergénio respiratório TMAC, que reage preferencialmente com grupos amina, induziu uma depleção de glutationa mais tardia como consequência do aumento do ROS mitocondrial. Estes resultados correlacionam-se com a intensidade com que determinadas vias de sinalização são ativadas e, por conseguinte, com a expressão diferencial de genes como HMOX e NQO1. Em conjunto, estes resultados sugerem que a polarização Th1 induzida por alergénios cutâneos resulta de uma produção de citocinas pró-inflamatórias e expressão de moléculas co-estimuladoras mantidas ao longo do tempo, enquanto a polarização Th2 é caracterizada por uma produção modesta e transitória. Uma vez que muitos dos mediadores moleculares responsáveis pelo recrutamento, diferenciação e maturação DC, estão descritos como ativadores do inflamassoma, numa segunda abordagem, foram caracterizados os mecanismos de ativação do inflamassoma por alergénios cutâneos e respiratórios. Os inflamassomas são complexos proteicos citoplasmáticos que ativam a caspase-1 e promovem a maturação e secreção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1ß e a IL-18. Atualmente, o inflamassoma mais estudado é o NLRP3 e pode ser ativado por uma variedade de estímulos tais como efluxo de potássio, destabilização do lisossoma, ROS e destabilização da mitocôndria. Apesar da destabilização do lisossoma estar maioritariamente associada a partículas com estrutura cristalina, os resultados apresentados nesta dissertação demonstram que o alergénio DNFB ativa o inflamassoma NLRP3 via destabilização lisossomal e consequente libertação da enzima catepsina B. O pré-tratamento das células com um inibidor da catepsina B diminui a ativação do inflamassoma NLRP3 induzida pelo DNFB, assim como a expressão do marcador de maturação CD86, revelando ser um mecanismo crucial para o desenvolvimento de ACD em resposta a alergénios de baixo peso molecular. Este novo mecanismo de ativação do inflamassoma foi igualmente observado com outros alergénios com elevada reatividade para grupos tiol, sugerindo que este mecanismo pode ser comum a alergénios com elevada reatividade para grupos tiol. Foi também proposto um novo método para imunoprecipitar proteínas haptenizadas pelo DNFB, não só como uma ferramenta para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à destabilização do lisossoma pelo DNFB, mas também na perspectiva de identificação de novos alvos terapêuticos para a ACD. Na sua globalidade, os resultados descritos nesta dissertação fornecem evidências importantes sobre o envolvimento diferencial das alarminas na ACD e sensibilização respiratória, as quais são cruciais para o desenvolvimento de uma resposta imunológica Th1 ou Th2. Adicionalmente, e tendo em conta o estado da arte, este é o primeiro estudo que reporta a ativação do inflamassoma por um alergénio envolvendo a destabilização do lisossoma.
Description: Tese no âmbito do Doutoramento em Ciências Farmacêuticas, ramo de Farmacologia e Farmacoterapia, orientada pela Professora Doutora Maria Celeste Lopes, Professora Doutora Maria Teresa de Teixeira Cruz Rosete e pelo Professor Doutor Bruno Miguel Rodrigues das Neves e apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/96420
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:FFUC- Teses de Doutoramento
UC - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat Login
Tese Doutoramento_ Isabel Ferreira_corrigida.pdf14.75 MBAdobe PDFEmbargo Access    Request a copy
Show full item record

Page view(s)

28
checked on Nov 26, 2021

Download(s)

2
checked on Nov 26, 2021

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.