Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/96152
Title: Development of LC-MS/MS method for the determination of glutamine and GABA in CSF — case study on Alzheimer's disease patients
Other Titles: Desenvolvimento de um método LC-MS/MS para a determinação de glutamina e GABA em LCR — caso de estudo em pacientes com a Doença de Alzheimer
Authors: Muñoz, Erika Jahaira Góngora
Orientador: Mandas, Bruno José Fernandes Oliveira
Rodrigues, João Eduardo Aleixo
Pereira, Jorge Luís Gabriel Ferreira da Silva Costa
Keywords: Doença de Alzheimer; LCR; Biomarcadores; Neurotransmissores; LC-MS/MS; Alzheimer's disease; CSF; Biomarkers; Neurotransmitters; LC-MS/MS
Issue Date: 22-Sep-2021
Serial title, monograph or event: Development of LC-MS/MS method for the determination of glutamine and GABA in CSF — case study on Alzheimer's disease patients
Place of publication or event: Center for Neuroscience and Cell Biology, UC-Biotech, Cantanhede
Abstract: A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela morte de neurónios em uma região específica do cérebro, condicionando a pessoa afetada à degeneração da memória, comprometimento cognitivo grave e deficiência funcional. O número de pessoas que sofrem de demência relacionada à DA é de cerca de 50 milhões, com este número aumentando rapidamente à medida que aumenta o envelhecimento da população em todo o mundo. O envolvimento de vários sistemas neurotransmissores (dopamina, glutamato, GABA, acetilcolina e serotonina) tem sido progressivamente associado a vários distúrbios neurológicos, incluindo a doença de Alzheimer.Portanto, a medição e avaliação desses neurotransmissores tornaram-se imperativas para múltiplos propósitos, incluindo o diagnóstico da doença na fase pré-clínica, previsão/monitorização do comprometimento cognitivo e o desenvolvimento da terapia farmacológica. Aqui é descrito um método de cromatografia acoplada ao método de espectrometria de massa (LC-MS/MS) utilizando um equipamento híbrido (quadropolo - tempo de voo Qq-TOF) para a separação e (semi) quantificação de glutamina, glutamato, ácido aminobutírico (GABA), acetilcolina (Ach), e colina (Cho) em amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR). O método não usa derivatização; apenas um padrão interno marcado para cada analito e tem um tempo de execução de 15 min. Para atingir este objetivo, a injeção direta de analitos individuais no sistema MS e LC-MS/MS foi realizada como parte de uma etapa de otimização do método, sendo possível estimar as condições ótimas para cada analito em termos de separação cromatográfica e fragmentação adequada no MS, configurando o experimento em modo HR-MRM.Após a otimização do método analítico, foi realizado um procedimento de validação para testar a capacidade do método ser aplicado na gama estabelecida. O método foi validado quanto à linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação.Em testes preliminares para ambos os analitos do metabolismo colinérgico, ACh e Cho, foi observado um comportamento não linear do sinal de resposta produzido em relação à concentração,gerando picos intensos a partir de baixas concentrações e mantendo valores aproximados em toda a faixa de concentração. Por conta disso, a validação foi realizada com foco nos analitos do metabolismo glutamatérgico,sendo demonstrada a linearidade do método para glutamato, glutamina e GABA. Uma regressão linear ponderada foi necessária devido à heterocedasticidade dosresultados.Os limites inferiores de quantificação (LOQ) foram estabelecidos em 0.02, 0.03, and 0.002 pmol/mM para glutamato, glutamina e GABA, respectivamente, e a precisão e exatidão foram determinadas para os três compostos em termos de desvio padrão relativo (% RSD) e erro relativo (% RE).Depois da validação, o método foi aplicado para medir os compostos em amostras de LCR de pacientes com DA pertencentes a 2 grupos diferentes Ab- e Ab+. Diferenças significativas foram encontradas entre as mulheres dos grupos Aβ+ e Aβ- para as quantidades obtidas da glutamina, indicando aumento significativo deste analito nas mulheres com Aβ+. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas entre os pacientes com Aβ+ e Aβ-. Encontramos ainda uma diminuição significativa nos níveis de GABA no LCR em Aβ+ em pacientes com mais de 60 anos de idade. Em contraste, não foram observadas alterações significativas nos pacientes com Aβ+ e Aβ-, nem nos dados baseados no sexo. No caso do glutamato, os efeitos da matriz afetaram a capacidade do método de mensurar esse analito, não sendo possível sua medição. Além disso, um aumento significativo nas medições de razão de GABA/glutamina foi encontrado nas mulheres do grupo Aβ-,é provável que a produção de glutamina aumentou enquanto GABA diminuiu em pacientes Aβ+ do sexo feminino, como um reflexo dos níveis aumentados de glutamato neste grupo. No entanto, para sugerir isso, é necessário ter medições de glutamato e estudos de várias vias metabólicas.
Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by the death of neurons in a specific brain region, conditioning the affected person to memory degeneration, severe cognitive impairment, and functional disability. The number of people suffering from AD-related dementia is around 50 million, with this number rapidly rising as increase the aging of the population worldwide. The involvement of several neurotransmitter systems (dopamine, glutamate, GABA, acetylcholine, and serotonin) has been progressively linked to several neurological disorders, including Alzheimer’s disease. Therefore, the measurement and evaluation of these neurotransmitters have become imperative for multiple purposes, including the diagnosis of the disease in the preclinical stage, prediction/monitoring of the cognitive impairment, and the development of pharmacologic therapy. Here is described a chromatography method coupled with the mass spectrometry (LC-MS/MS) method using a hybrid equipment (quadrupole - time of flight Qq-TOF) for the separation and (semi) quantification of glutamine, glutamate, aminobutyric acid (GABA), acetylcholine (Ach), and choline (Cho) in cerebrospinal fluid (CSF) samples. The method does not use derivatization; only a labeled internal standard for each analyte is used and has a run time of 15 min. To achieve this purpose, the direct injection of individual analytes into the MS and LC-MS/MS system was carried out as part of a method optimization stage, it was possible to estimate the optimal conditions for each analyte in terms of chromatographic separation and an adequate fragmentation in the MS, setting up the experiment in an HR-MRM mode. After the optimization of the analytical method, a validation procedure was carried out in order to test the ability of the method to be applied in the established range. The LC-MS/MS method was validated with respect to linearity, precision, accuracy, the limit of detection, and the limit of quantification. In the preliminary tests for both analytes of cholinergic metabolism, ACh and Cho, a non-linear behavior of the response signal produced with respect to concentration was observed, generating intense peaks from low concentrations and maintaining approximate values throughout the concentration range. Because of this, validation was performed with a focus on glutamatergic metabolism analytes, being demonstrated the linearity of the method for glutamate, glutamine, and GABA. A weighted linear regression was required due to the heteroscedasticity of the results.The lower limits of quantification (LOQ) were established at 0.02, 0.03, and 0.002 pmol/μM for glutamate, glutamine, and GABA, respectively, and the precision and accuracy were determined for the three compounds in terms of relative standard deviation (% RSD) and relative error (% RE). Once the method was validated, it was applied to measure the compounds in CSF samples from patients with AD belonging to 2 different groups Aβ- and Aβ+. Significant differences were found between the females of Aβ+ and Aβ- groups for the measurements obtained from glutamine, indicating a significant increase in the females with Aβ+. However, no significant differences were found between the AD patients with Aβ+ and Aβ-. We further found a significant decrease in CSF GABA levels in Aβ+ from patients older than 60 years old. In contrast, no significant changes were observed in patients with Aβ+ and Aβ-, nor in the data based on gender. In the case of glutamate, the effects of the matrix affected the ability of the method to measure this analyte, so its measurement was not possible.Furthermore, a significant increase in the ratio measurements of GABA/glutamine was found in the Aβ- group of females, it is likely that glutamine production increased while GABA decreased in Aβ+ female patients, as a reflection of the increased glutamate levels in this group. Nevertheless, to suggest this it is necessary to have glutamate measurements and studies of various metabolic pathways.
Description: Dissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/96152
Rights: openAccess
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