Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/96052
Title: Parthenolide: therapeutic potential in multiple myeloma resistant to proteasome inhibitors.
Other Titles: Partenolide: potencial terapêutico em mieloma múltiplo resistente a inibidores de proteossoma.
Authors: Oliveira, Inês Catarina Campos de
Orientador: Gonçalves, Ana Cristina Pereira
Alpoim, Maria Carmen Martins de Carvalho
Keywords: Mieloma multiplo; Resistência a fármacos; Inibidores de proteossoma; Partenolide; Multiple myeloma; Drug resistance; Proteosome inhibitors; Parthenolide
Issue Date: 3-Sep-2021
Serial title, monograph or event: Parthenolide: therapeutic potential in multiple myeloma resistant to proteasome inhibitors.
Place of publication or event: Laboratório de Oncobiologia e Hematologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Abstract: O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela expansão de plasmócitos clonais que produzem imunoglobulinas monoclonais e pela presença de um ou mais eventos definidores de mieloma, que consistem em características CRAB (hipercalcemia, insuficiência renal, anemia e Lesões Osteolíticas/bone lesions) e/ou um ou mais biomarcadores de malignidade (plasmócitos clonais ≥ 60%, razão entre cadeias leves livres séricas envolvidas/não envolvidas ≥ 100, e presença de pelo menos uma lesão focal em exames de ressonância magnética).A ativação do fator nuclear-kB (NF-κB) é um evento muito comum em MM, sendo este fator uma das moléculas mais importantes envolvidas na resposta inflamatória, ligando a inflamação crónica ao cancro. O NF-κB é um complexo homo ou heterodimérico que se apresenta geralmente na forma de dímeros p65-p50. Os dímeros ligam-se a locais específicos do DNA dos seus genes-alvo, promovendo a sua transcrição. Apesar de existirem inúmeras possibilidades terapêuticas para um doente com MM incluindo inibidores do proteassoma (PIs), como bortezomib (BTZ), carfilzomib (CFZ) e ixazomib (IXZ) e imunomoduladores que aumentam a esperança média de vida dos doentes, ao mesmo tempo que melhoram a sua qualidade de vida, a resistência a fármacos ainda é um grande obstáculo que precisa ser ultrapassado. Consequentemente, os medicamentos disponíveis deixam de ser uma opção para aqueles que desenvolvem resistência. Por esse motivo, novos agentes anticancerígenos, tal como o partenolide (PTL), um inibidor da ativação do NF-kB, poderá ser necessário para ultrapassar a resistência a fármacos. Além da sua atividade anti tumoral ser mediada pela inibição da via de sinalização do NF-κB, o PTL também reduz o nível celular de glutationa e induz a produção de espécies reativas de oxigénio, induzindo stresse oxidativo.Nesse contexto, o principal objetivo do presente projeto é avaliar o papel do PTL em contornar a resistência do mieloma múltiplo aos inibidores do proteassoma BTZ, CFZ e IXZ. Para o efeito, foram utilizadas linhas celulares de MM sensíveis (H929) e resistentes aos inibidores de proteossoma BTZ, CFZ e IXZ (H929-BTZ, H929-CFZ e H929-IXZ, respetivamente) foram incubadas na presença e na ausência de PTL, e procedeu-se ao ensaio metabólico com resazurina para verificar a atividade metabólica celular. O tipo de morte celular induzida pela PTL foi analisado não só por citometria de fluxo (CF), utilizando a dupla coloração com anexina-V e 7-AAD, mas também por microscopia ótica, após a coloração segundo o protocolo May-Grünwald Giemsa. Para além disso, verificou-se o efeito do PTL no ciclo celular por CF, utilizando a solução de iodeto de propídio/RNase. Também se verificaram os níveis de peróxidos intracelulares utilizando a sonda DCFH2-DA e o nível do ΔΨM por CF. Por último, o efeito da PTL na expressão génica foi avaliado por qPCR.Este projeto comprovou que o PTL é capaz de reduzir a atividade metabólica das linhas celulares estudadas, dependendo do tempo de incubação, da concentração e da linha celular. De facto, a linha celular resistente H929-IXZ mostrou-se menos sensível à ação do parthenolide. Assim, às 72 horas os valores do IC50 foram de 2,40; 0,96; 2,37 e 7,32 μM para as linhas celulares H929, H929-BTZ, H929-CFZ e H929-IXZ, respetivamente. Para além disso, o PTL induziu um aumento significativo na percentagem de células apoptóticas em todas as linhas celulares (H929-BTZ mostrou um aumento de 12%, H929-CFZ mostrou um aumento de 19,75% e H929-IXZ mostrou um aumento de 20%). Além do mencionado, nas células tratadas com PTL disso observou-se um aumentou dos níveis intracelulares de peróxidos em 1,40 vezes, 1,12 vezes, 1,14 vezes e em 1,32 vezes nas linhas celulares H929, H929-BTZ, H929-CFZ e H929-IXZ respetivamente. Paralelamente, verificou-se um aumento do rácio M/A de JC-1 de cerca de 1,41 vezes, 1,82 vezes, 2,60 vezes e 4,67 vezes nas linhas celulares H929, H929-BTZ, H929-CFZ e H929-IXZ respetivamente, sugerindo que o PTL induz diminuição do potencial de membrana mitocondrial. Concluindo, este estudo provou que o PTL é capaz de contornar a resistência aos PIs, podendo constituir uma nova abordagem terapêutica no MM resistente a estes fármacos.
Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasm characterized by the expansion of clonal plasma cells that produce monoclonal immunoglobulins and by the presence of one or more myeloma-defining events, which consist of CRAB features (hypercalcemia, renal failure, anemia and bone lesions) and/or one or more malignancy biomarkers (clonal plasma cells ≥ 60%, ratio of serum free light chains involved/not involved ≥ 100, and the presence of at least one focal lesion on MRI scans).Activation of nuclear factor-kB (NF-κB) is a very common event in MM, and this factor is one of the most important molecules involved in the inflammatory response, linking chronic inflammation to cancer. NF-κB is a homo- or heterodimeric complex that is generally in the form of p65-p50 dimers. Dimers bind to specific locations in the DNA of their target genes, promoting their transcription.Choosing the right treatment for a MM patient is a complicated decision as there are several therapeutic possibilities. Some of the treatment options include proteasome inhibitors (PIs) such as bortezomib (BTZ), carfilzomib (CFZ) and ixazomib (IXZ). Although the chemotherapeutic drugs used to treat MM increase the average life expectancy of patients, while improving their quality of life, drug resistance is still a major obstacle that needs to be addressed. Consequently, available drugs can end up not being an option for those who develop resistance. For this reason, new anticancer agents, such as parthenolide (PTL), are needed to overcome drug resistance. In this context, the main objective of this project is to evaluate the role of PTL in circumventing multiple myeloma resistance to BTZ, CFZ and IXZ proteasome inhibitors. This compound exerts its anti-tumor activity by inhibiting the NF-κB signaling pathway. PTL also reduces the cellular level of glutathione and induces the production of reactive oxygen species, inducing oxidative stress.For this purpose, MM cell lines that are sensitive (H929) and resistant to the proteosome inhibitors BTZ, CFZ and IXZ (H929-BTZ, H929-CFZ and H929-IXZ, respectively) were incubated in the presence of PTL, and the metabolic assay using resazurin was proceeded to verify the cellular metabolic activity. The type of cell death induced by PTL was analyzed not only by flow cytometry (FC), using annexin-V (AV)/7-AAD double staining, but also by optical microscopy, after the staining according to the May-Grünwald Giemsa protocol. Furthermore, the effect of PTL on the cell cycle was verified by FC using the propidium iodide/RNase solution. The levels of intracellular peroxides were also verified using the probe DCFH2-DA and the level of ΔΨM by FC. Finally, the effect of PTL on gene expression was assessed by qPCR.This project proved that PTL is able to reduce the metabolic activity of the cell lines studied, according to the incubation time and concentration used. Furthermore, resistant cell lines were generally less susceptible to the action of parthenolide. In fact, at 72 hours the IC50 values were 1.98, 1.20, 1.73 and 4.56 µM for cell lines H929, H929-BTZ, H929-CFZ and H929-IXZ, respectively. Furthermore, cell death analysis showed that PTL caused a significant increase in the percentage of apoptotic cells in all cell lines (H929-BTZ showed an increase of 12%, H929-CFZ showed an increase of 19.75% e H929-IXZ showed an increase of 20%). Furthermore, it increased intracellular peroxide levels by 1.40-fold, 1.12-fold, 1.14-fold and 1.32-fold in cell lines H929, H929-BTZ, H929-CFZ and H929-IXZ respectively. In parallel, there was an increase in the M/A ratio of 1.41-fold, 1.82-fold, 2.60-fold and 4.67-fold in cell lines H929, H929-BTZ, H929-CFZ and H929-IXZ respectively.In conclusion, this study proved that PTL is able to overcome resistance to PIs and may constitute a new therapeutic approach in MM resistant to these drugs.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/96052
Rights: openAccess
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