Metabolic modulation in paused-like pluripotency

Abstract

Embryonic diapause is a conserved reproductive strategy in which development arrests at the blastocyst stage. The in vitro induction of a diapause-like state could be an invaluable tool, not only to study the process of embryonic diapause, but also to evaluate the cellular and molecular effects of drugs and other external factors on diapaused blastocysts, embryonic reactivation and development. Recently, mTOR inhibition was shown to induce diapause on mouse blastocysts and a paused-like state on mouse embryonic stem cells (mESCs). Therefore, considering the described metabolic silencing observed in diapaused blastocysts and the array of cellular process that are mTOR-regulated, in this work we aimed to further characterize this new paused-pluripotent state, focusing on its glycolytic and oxidative metabolic function. Thus, we exposed mESCs, to the mTOR inhibitor INK-128 and evaluated proliferation, pluripotency status and energy-related metabolism, as well as the mTOR inhibition status and translational function. Unexpectedly, in our hands INK-128 did not inhibit the phosphorylation of mTOR or its downstream targets after 48 hours. Accordingly, no alterations on protein translational function were observed. Nonetheless, INK-128 could still successfully induce a paused-like state in naïve mESCs regardless of their culturing conditions, by greatly slowing proliferation without affecting pluripotency status. Interestingly, in this paused-like state, mESCs present a glucose-related hypometabolic profile, which is a hallmark of diapaused blastocysts, with decreased glycolytic and oxidative metabolism and decreased nutrient uptake. Despite the lack of mTOR inhibition and translational suppression, INK-128 still induced a paused-like pluripotent state through cell cycle and metabolic modulation, rather than by translational suppression, suggesting more than one avenue for this type of pluripotent phenotype. Since INK-128 and various other compounds applied to mESC culture are diluted in DMSO and DMSO has been shown to have often overlooked side-effects in both mouse and human ESC culture, it is important to evaluate the effect of very low doses of DMSO, usually used to introduce pharmacological inhibitors/modulators, in mESC culture. DMSO is a commonly used solvent in biological studies, as it is an amphipathic molecule soluble in both aqueous and organic media. For that reason it is the vehicle of choice for several water-insoluble substances used in research. At the molecular and cellular level DMSO is a hydrogen-bond disrupter, an intercellular electrical uncoupler and a cryoprotectant, among other properties. Importantly, DMSO has often overlooked side-effects. In stem cell research the published literature is scarce, but there are reports on the effect of DMSO in human embryoid body differentiation and on human pluripotent stem cell priming towards differentiation, via modulation of cell cycle. However, in mESC culture there is almost no available information. Taking into consideration the almost ubiquitous use of DMSO in experiments involving mESCs, the second aim of this thesis was to understand the effect of very low doses of DMSO (0.0001%-0.2%), usually used to introduce pharmacological inhibitors/modulators, in mESCs cultured in two different media. According to our results, in the mESC line used in this study, even the smallest concentration of DMSO had minor effects on the total number of cells in serum-cultured mESCs. However, these effects could not be explained by alterations in cell cycle or apoptosis. Furthermore, DMSO did not affect pluripotency or differentiation potential. All things considered it is thus reasonable to conclude that DMSO at very low concentrations has a minimal effect on this particular mESC line.

A diapausa embrionária é uma estratégia reprodutiva, na qual o desenvolvimento de um embrião é suspenso imediatamente antes do processo de implantação no útero materno. Esta estratégia evolutiva tem como objetivo interromper temporariamente e, deste modo, prolongar o tempo de gestação de um embrião quando as condições para o seu desenvolvimento não são as mais propícias, até circunstâncias mais favoráveis estarem disponíveis, permitindo assim o seu correto desenvolvimento. Recentemente foi demonstrado que a inibição da via mTOR induz um estado de diapausa em blastocistos de murganho e, de igual modo, um estado semelhante à diapausa em células estaminais embrionárias de murganho em cultura. Deste modo, considerando o silenciamento metabólico descrito em blastocistos em diapausa e a variedade de processos regulados pela via da mTOR, o objetivo principal desta tese é a caracterização mais aprofundada deste novo estado de pluripotência pausada, induzido pela inibição da via mTOR, focando a nossa atenção no perfil metabólico das culturas “pausadas”. Por conseguinte, expusemos células estaminais de murganho em cultura durante 48 horas ao inibidor da via mTOR, INK-128, e avaliámos a sua proliferação, estado de pluripotência e estado metabólico. De modo a provar o estado de supressão da via mTOR, também analisámos os níveis de expressão de algumas proteínas efetoras da via e investigámos o estado geral de tradução proteica das células expostas ao inibidor. Inesperadamente, nas nossas condições de cultura, o inibidor INK-128 não inibiu a fosforilação da proteína mTOR, nem das proteínas suas efetoras, para além de não ter afetado o estado traducional das culturas. No entanto, o inibidor conseguiu com sucesso induzir um estado semelhante à pluripotência pausada, uma vez que suspendeu a proliferação de células estaminais em cultura, sem aumentar os níveis de apoptose nem afetar o estado de pluripotência das células. Este estado semelhante de pluripotência pausada apresentou também um decréscimo acentuado dos níveis de glicólise e metabolismo oxidativo, correspondentes a um perfil hipometabólico, semelhante ao observado em blastocistos em diapausa. Em suma, apesar da ausência de inibição da via da mTOR, a molécula INK-128 conseguiu induzir um estado semelhante à pluripotência pausada, através da modulação do ciclo celular e metabolismo de células estaminais embrionárias, sugerindo uma via alternativa de indução deste fenótipo de pluripotência. Uma vez que o inibidor INK-128, bem como muitos outros agentes farmacológicos utilizados na cultura de células estaminais, é diluído em DMSO, e que o DMSO tem efeitos a nível da cultura de células estaminais comumente negligenciados, o segundo objetivo desta tese foi avaliar o efeito de pequenas concentrações de DMSO, frequentemente usadas na introdução de moduladores/fármacos, no estado da cultura de células estaminais. O DMSO é um solvente ubiquamente usado em estudos biológicos, uma vez que é uma molécula anfipática solúvel em meios tanto orgânicos como inorgânicos. Por esse motivo, é usada como veículo de eleição de variadas substâncias insolúveis em água, em vários trabalhos de investigação científica. No entanto, o DMSO pode causar vários efeitos secundários muitas vezes desvalorizados. No âmbito da investigação em células estaminais, existe pouca literatura referente a este tópico, porém existem algumas evidências que o DMSO pode influenciar e instigar o processo de diferenciação de células estaminais humanas em cultura através da modulação do ciclo celular. Tendo isso em consideração e uma vez que a informação publicada sobre o efeito do DMSO em células estaminais de murganho é escassa, o segundo objetivo desta tese foi a avaliação do efeito de pequenas concentrações de DMSO (0.0001%-0.2%), frequentemente usadas na introdução de moduladores/fármacos, na proliferação, pluripotência e potencial de diferenciação cultura de células estaminais de ratinho. De acordo com os resultados obtidos, nesta linha particular de células estaminais de ratinho, a mais pequena concentração de DMSO afetou minimamente o total de células em cultura após 48 horas de exposição ao DMSO. No entanto, não foi possível associar esse efeito a alterações tanto do ciclo celular como de perfil apoptótico. Além do mais, o DMSO não afetou nem o estado de pluripotência das culturas nem afetou o seu potencial de diferenciação. Em suma, é razoável concluir que esta gama de concentrações tem efeitos mínimos na cultura de células estaminais desta linha em particular.