Smart delivering and drug targeting to treat fibrosis in age-related macular degeneration

Abstract

A degenerescência macular da idade (DMI) é uma doença crónica e progressiva, caraterizada por perda da visão central, em indivíduos acima dos 50 anos de idade. Nas fases iniciais, a DMI é geralmente assintomática, não estando associada à diminuição da acuidade visual. No entanto, a doença pode progredir para formas mais avançadas, como a forma não exsudativa e a forma neovascular, que se manifestam por atrofia geográfica e a neovascularização coroideia, respetivamente. Em alguns casos, o descolamento do epitélio pigmentado da retina e a fibrose sub-retiniana também se encontram presentes nas formas avançadas da DMI. Apesar da administração de injeções intravítreas de agentes anti-VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) poder inibir a formação de novos vasos da coróide e permitir uma melhoria da acuidade visual, esta é temporária e, por outro lado, existem alguns doentes que não respondem ao tratamento. Além disso, este tipo de tratamento pode aumentar a fibrose na neovascularização da coróide (CNV). Em alguns casos, a terapia fotodinâmica (PDT) é utilizada em combinação com a terapia anti-VEGF. A PDT combina três componentes não tóxicos: fotossensibilizador (PS), luz com comprimento de onda apropriado e oxigénio molecular. O tratamento da forma exsudativa da DMI com PDT envolve a administração de um fotossensibilizador (PS) por via intravenosa. Após acumulação na retina, o PS é ativado com luz de comprimento de onda apropriado. Quando fotoativado, o PS gera espécies reativas de oxigénio (ROS) que promovem a oclusão da membrana neovascular, havendo destruição dos neovasos da coróide. No entanto, a PDT no tratamento da DMI tem caído em desuso desde o aparecimento dos anti-VEGF. As galectinas são uma família de proteínas que têm uma função importante no desenvolvimento da CNV e fibrose sub-retiniana na DMI. O principal objetivo deste estudo foi investigar de que forma uma nanoformulação de exossomas com uma porfirina é capaz de potenciar a eficácia da PDT na DMI. Neste estudo, utilizou-se um PS galacto-conjugado (ZnTPPF16(SGal)4), que poderá eventualmente ser reconhecido pela galectina-1, que se encontra sobre-expressa nos estádios mais avançados da DMI.Os exossomas isolados do meio condicionado de células ARPE-19 e de eyecups de suínos, foram caraterizados por Western Blotting e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). O complexo exossoma-ZnTPPF16(SGal)4 foi caraterizado em termos fotofísicos, nomeadamente por estudos de absorvência e de fluorescência devido às propriedades óticas do nosso composto. Resultados de microscopia eletrónica de transmissão sugeriram que o ZnTPPF16(SGal)4 foi encapsulado em exossomas. Foram realizados estudos in vitro com ZnTPPF16(SGal)4 livre vs ZnTPPF16(SGal)4 exossomal utilizando a linha celular ARPE-19 (com morfologia reminiscente de fibroblastos) de forma a avaliar a captação dos mesmos pelas células e a citotoxidade no escuro e após irradiação com luz. O ZnTPPF16(SGal)4 foi captado pelas células ARPE-19. Tanto o ZnTPPF16(SGal)4 livre como o ZnTPPF16(SGal)4 exossomal não são tóxicos no escuro. Após fotoativação, ambos são eficazes na indução de morte das células ARPE-19. No entanto, ZnTPPF16(SGal)4 exossomal não potenciou o efeito fotodinâmico. Serão necessários estudos mais detalhados, com métodos alternativos que permitam um encapsulamento mais eficiente do ZnTPPF16(SGal)4 em exossomas, assim como, investigação adicional da sua eficácia terapêutica para a fibrose sub-retiniana e CNV na DMI.

Age-related macular degeneration (AMD) is a progressive, chronic disease that affects individuals over 50 years and induces loss of central vision. Early stages of AMD are not usually associated with declined in visual acuity. However, the disease can progress from early to advanced forms, dry and wet AMD, in which geographic atrophy of the retinal pigment epithelium and choroidal neovascularization occur, respectively. In some cases, RPE detachment and subretinal fibrosis are also present in advanced forms of AMD. Although administration of intravitreal injections with anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) drugs can stop the formation of new vessels from choroid or improve temporarily the visual acuity, there are some individuals that do not respond to the treatment. Moreover, this kind of treatment can increase fibrosis in CNV. In some cases, photodynamic therapy (PDT) is used in combination with anti-VEGF therapy. PDT is based on three non-toxic components: photosensitizer (PS), light with the appropriate wavelength and oxygen. In the treatment of neovascular form of AMD by PDT, a photosensitizer is administered intravenously and accumulated in the retina. When the eye is exposed to an appropriate wavelength of light, this PS generates reactive oxygen species (ROS) resulting in CNV vaso-occlusion and consequent death of abnormal vessels from choroid. However, currently there is no therapy to subretinal fibrosis. Galectins are a family of proteins that play an important role both in CNV and subretinal fibrosis in AMD.The main purpose of this study was to investigate whether a based exosome-porphyrin nanoformulation is able to enhance AMD PDT efficacy. In this work, a PS-carbohydrate conjugate, ZnTPPF16(SGal)4, which could be recognized by galectin-1, which is overexpressed in advanced AMD. We characterized the exosomes isolated from conditioned media of ARPE -19 cell line and porcine eyecups, using Western Blot and NTA techniques. For the encapsulation of the photosensitizer, we used exosomes isolated from the retinal pigment epithelium of porcine eyecups. Exosomal ZnTPPF16(SGal)4 have been purified and characterized in photophysical terms, namely by absorbance and fluorescence studies due to the optic properties of our compound. Transmission electron microscopy analysis has suggested ZnTPPF16(SGal)4 was encapsulated in exosomes. Biological studies of the free ZnTPPF16(SGal)4 vs exosomal ZnTPPF16(SGal)4 were performed on an ARPE-19 cell line (with morphology reminiscent of fibroblasts). It was found that ZnTPPF16(SGal)4 was internalized by ARPE-19 cells. Both ZnTPPF16(SGal)4 and exosomal ZnTPPF16(SGal)4 were non-toxic until activation by light. ZnTPPF16(SGal)4 demonstrated high efficacy in inducing ARPE-19 cell death after photoactivation. However, the exosomal ZnTPPF16(SGal)4 did not enhance PDT. Further detailed studies with alternative methods that offer more efficient encapsulation of ZnTPPF16(SGal)4 in cell-derived exosomes, as well as further investigation towards therapeutic efficacy for sub-retinal fibrosis and CNV in AMD, are required.