Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/94281
Title: Detection of leukemia-associated immunophenotypic protein markers in circulating extracellular vesicles from acute myeloid leukemia patients
Other Titles: Deteção de marcadores proteicos imunofenotipicos associados à leucemia nas vesículas extracelulares de doentes com leucemia mielóide aguda
Authors: Carreira, Joana Sofia Camilo
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento Antunes Cruz
Meehan, Maria Helena da Silva de Vasconcelos
Keywords: Leucemia Mieloide Aguda; Doença Residual Mínima; Vesículas Extracelulares; Biomarcadores; Acute Myeloid Leukaemia; Measurable Residual Disease; Extracellular Vesicles; Biomarkers
Issue Date: 10-Dec-2020
Serial title, monograph or event: Detection of leukemia-associated immunophenotypic protein markers in circulating extracellular vesicles from acute myeloid leukemia patients
Place of publication or event: i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde
Abstract: A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela acumulação de progenitores mieloides leucémicos na medula óssea. A elevada taxa de mortalidade aos 5 anos após o diagnostico está relacionada com a presença de quantidades residuais de células leucémicas que são responsáveis pela recaída e que não são detetadas pelos atuais métodos de diagnostico. Desta forma, a monitorização da doença residual mensurável (DRM), utilizando técnicas moleculares mais sensíveis, permite a identificação dos doentes com risco acrescido de recidiva. Marcadores proteicos imunofenotipicos associados à leucemia (LAIPs) são atualmente úteis para detetar DRM. Infelizmente, esta monitorização não é realizada frequentemente e em tempo-real devido á necessidade de recolha invasiva de um aspirado de medula óssea. Assim, a identificação de biomarcadores de DRM, baseados numa biópsia líquida utilizando sangue periférico dos doentes, permitiria uma monitorização em tempo real e menos invasiva da DRM. Recentemente, as vesículas extracelulares (EVs) foram reconhecidas como uma potencial fonte de biomarcadores do cancro em biópsias líquidas.Neste trabalho procuramos validar um protocolo de isolamento de EVs, usando o sangue periférico de doentes com LMA e ainda verificar a presença de LAIPs nas EVs em circulação ao longo dos diferentes estádios da doença.Para tal, os constituintes do plasma pobre em plaquetas foram separados por tamanho, utilizando um protocolo de cromatografia por exclusão molecular (SEC), sendo as EVs posteriormente concentradas por ultrafiltração (UF). A recuperação da amostra foi analisada nas diferentes fases de isolamento. As EVs eluídas foram caracterizadas de acordo com seu tamanho, concentração e conteúdo proteico. Por fim, a presença de vários LAIPs nas EVs foi analisada e semi-quantificada usando Western Blot. O protocolo implementado permitiu o isolamento de EVs de acordo com o seu tamanho, a partir do sangue periférico de doentes com LMA. As EVs isoladas apresentaram um tamanho que variou entre os 50nm a 300nm, eram abundantes no plasma destes doentes e expressavam marcadores proteicos associados a EVs, tais como a CD63, HSP70, Anexina XI, CD81, CD9 e a Mitofilina. A UF permitiu aumentar a concentração proteica e o número de partículas necessários à etapa seguinte. Por fim, vários marcadores imunofenotipicos clinicamente estabelecidos associados à LMA (LAIPs) foram identificados nas EVs circulantes destes doentes, revelando uma expressão diferencial nos vários estádios da doença. Concluindo, validamos com sucesso um protocolo para o isolamento de EVs a partir do sangue de doentes com LMA. Além disso, os resultados preliminares sugerem que alguns LAIPs poderão ter potencial como biomarcadores de DRM em EVs de plasma sanguíneo, uma vez que seus níveis variam de acordo com o estádio da doença. Trabalho futuro irá confirmar esta hipótese.
Acute myeloid leukaemia (AML) is a hematopoietic stem cell disorder characterized by the accumulation of myeloid progenitors in the bone marrow. The poor 5-year survival rate is related to the undetected residual amounts of leukemic cells by microscopic assessment, which translates into a high frequency of post-treatment relapse. Monitoring this measurable residual disease (MRD) by sensitive molecular techniques allows the identification of patients who are at risk for an early relapse. Many different leukaemia associated immunophenotypic protein markers (LAIPs) are presently useful to detect MRD. Their analysis requires invasive bone marrow aspirates, thus severely hindering real-time monitoring of the disease. Therefore, the identification of innovative liquid biopsy-based biomarkers of MRD in patients’ peripheral blood (PB) would allow minimally invasive and real-time monitoring of MRD. Recently, extracellular vesicles (EVs) have been recognized as a potential source of cancer biomarkers.Here we aimed to implement and validate an EV isolation protocol from the PB of AML patients and perform a comprehensive characterization of LAIPs in the AML patients’ circulating EVs throughout the different stages of the disease.For that, Poor Platelet Plasma constituents were resolved by size, using a size-exclusion chromatography (SEC) method, and were further concentrated by an Ultrafiltration (UF) approach. The recovery yield of the sample was verified in each stage of this two-step protocol. The isolated EVs were characterized accordingly to their size, concentration (by Nanoparticle Tracking Analysis), and protein content (by Western Blot). Finally, the LAIPs presence in EVs was analysed and semi-quantified by WB following protein extraction.This two-step protocol allowed the isolation of intact and size resolved EVs from the PB of AML patients. The isolated EVs had a size ranging from 50nm to 300nm, were highly abundant and expressed EV-associated protein markers such as CD63, HSP70, Annexin XI, CD81, CD9, and Mitofilin. The UF allowed the required protein and particle concentration required for downstream analysis by WB. Importantly, several LAIPs were identified in paired samples of diagnosis, remission and relapse of seven patients’ circulating EVs, revealing a differential expression throughout the disease evolution.Taken together, a two-step protocol was validated for the isolation of EVs from the PB plasma and several EV-associated LAIPs were monitored in the blood of AML patients throughout distinct stages of the disease. The preliminary results indicate that some of these markers may have potential as MRD biomarkers detected in EVs from blood plasma, since their levels vary according to the disease status. Future work will confirm this possibility.
Description: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
URI: http://hdl.handle.net/10316/94281
Rights: embargoedAccess
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