Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/93942
Title: Astrocytic cAMP Signaling and Metabolism: Adenosine A2A Receptors Modulation
Other Titles: Sinalização de cAMP e Metabolismo nos Astrócitos: Modulação por Recetores de Adenosina A2A
Authors: Dias, Rafael Mendes
Orientador: Tomé, Ângelo José Ribeiro
Agostinho, Paula Maria Garcia
Keywords: cAMP; astróctios; transporte da glucose; glucose-6-fosfatase-β; recetores de adenosina A2A; cAMP; astrocytes; glucose transport; glucose-6-phosphatase-β; adenosine A2A receptors
Issue Date: 3-Dec-2020
Serial title, monograph or event: Astrocytic cAMP Signaling and Metabolism: Adenosine A2A Receptors Modulation
Place of publication or event: CNC - Centre for Neuroscience and Cell Biology
Abstract: Astrócitos, células do Sistema Nervoso Central, não geram potenciais de ação, mas, em resposta a estímulos, os seus níveis intracelulares de cAMP e Ca2+ podem oscilar. Os astrócitos são importantes para os processos metabólicos das células cerebrais devido à sua capacidade de acumular glicogénio no citoplasma e glucose no retículo endoplasmático, graças à ação da glucose-6-fosfatase-β (G6Pase-β). O consumo de glucose e glicogénio pelos astrócitos origina lactato, que é transportado para neurónios. Compreender as características espácio-temporais da sinalização de cAMP em astrócitos é importante, uma vez que este governa vários processos celulares, como o metabolismo da glucose, e disfunções na sua manutenção podem levar a várias patologias, como a doença de Alzheimer (AD). Esta é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada por perda progressiva de memória, e a acumulação de peptídeo β-amiloide (Aβ) está envolvido na sua patogénese. Os astrócitos sofrem alterações em AD, apresentando alterações em recetores, como os recetores da adenosina A2A (A2AR), e nas suas vias de sinalização. Em astrócitos, sinais de cAMP e Ca2+ podem surgir após a ativação de recetores acoplados a proteínas G (GPCRs) membranares, como os A2AR, que regulam funções astrocíticas, como a ativação de adenilato ciclase (AC), e subsequente produção de cAMP, e captação e metabolismo de glucose. Assim, é possível que condições tipo-AD possam causar alterações nessas funções. Os principais objetivos deste estudo foram: i) estabelecer uma nova metodologia para observar níveis de cAMP em tempo real usando proteínas fluorescentes em astrócitos; ii) avaliar o efeito de cAMP e A2AR na captação de glucose, exportação de lactato e níveis de G6Pase-β em astrócitos em cultura, em condições não-patológicas e de AD, mimetizadas pela exposição a Aβ1.-42.Para tal, usámos culturas primárias de astrócitos transfectados com diferentes reagentes e diferentes plasmídeos (R-FlincA e Pink Flamindo). Astrócitos transfectados foram observados num microscópio de fluorescência e estimulados para aumentar os níveis de cAMP. Para avaliar a captação de glucose e lactato, os astrócitos foram incubados com compostos que modulam AC, forscolina (FSK, ativador da AC), KH 7 (inibidor da AC) e com compostos que interferem com os recetores de adenosina: SCH 58261 (antagonista seletivo de A2AR), CGS 21680 (agonista seletivo de A2AR), com os antagonistas não seletivos de recetores de adenosina, cafeína e teobromina, e com adenosina deaminase (ADA), que degrada a adenosina extracelular. Noradrenalina, um agonista de GPCRs, e dbcAMP (análogo de cAMP) também foram testados. Investigámos se as condições tipo-AD (exposição a Aβ1-42) afetaram a captação de glucose e lactato e os níveis de G6Pase-β, e se esse impacto foi modulado por recetores de adenosina. A captação de glucose e trnasporte de lactato foram avaliados com kits enzimáticos, enquanto os níveis de G6Pase-β foram quantificados por análise de Western blot.Apesar de incapazes de transfectar astrócitos de uma forma confiável para observar dinâmicas de cAMP, fizemos grandes avanços para implementar esta metodologia no grupo para o futuro. No entanto, reunimos dados que mostram que os astrócitos transfectados com Pink Flamindo expressaram a proteína-sensor de cAMP e mantiveram sua excitabilidade, observando oscilações de Ca2+ intracelulares evocadas por ATP. Em relação ao nosso segundo objetivo: FSK e KH 7 não provocaram alterações significativas na captação de glucose; cafeína e teobromina reduziram significativamente (p<0.05) a captação de glucose, tal como Aβ1-42; SCH 58261 não induziu mudanças, o que indica que outros recetores de adenosina podem estar envolvidos; ADA reduziu significativamente a captação de glucose, indicando o envolvimento de um tônus de adenosina e, consequentemente, a ativação de recetores de adenosina na regulação da captação de glucose; CGS 21680 em condições tipo-AD, e dbcAMP diminuíram a captação de glucose significativamente (p<0.05 e 0.001), o que é inesperado, considerando que o aumento de cAMP devia aumentar a caprtação de glucose, restando esclarecer se o efeito de CGS 21680 está relacionado com o aumento (p<0.05) dos níveis de G6Pase-β observados em astrócitos expostos a CGS 21680. Na exportação de lactato, nenhum efeito significativo foi obtido graças a modulação dos A2AR ou exposição a Aβ1-42.Além de contribuir para o estabelecimento de uma nova metodologia no nosso grupo para observar oscilações de cAMP em células vivas, este estudo também mostrou que os recetores de adenosina, em particular A2AR, e as oscilações do cAMP regulam a captação de glucose em astrócitos, que é fundamental para a manutenção do seu metabolismo energético e, consequentemente, as suas funções. A captação de glucose nos astrócitos também diminui devido ao efeito de Aβ1-42, o que pode estar relacionado com a sobre-expressão dos A2AR previamente descrita em condições tipo- AD em astrócitos.
Astrocytes, cells of the Central Nervous System, do not generate action potentials, but, in response to extracellular stimuli, they can oscillate intracellular levels of cAMP and Ca2+. Astrocytes are important for metabolic processes of brain cells due to their capacity to accumulate glycogen in cytoplasm and glucose in endoplasmic reticulum (ER), through the action of glucose-6-phosphatase-β (G6Pase-β). Consumption of glucose and glycogen by astrocytes originates lactate, which will be transported into neurons. Understanding the spatio-temporal features of cAMP signaling in astrocytes is important, since cAMP governs many important cellular processes, like glucose metabolism, and malfunctions in its maintenance may lead to several pathologies, such as Alzheimer’s disease (AD). This is a neurodegenerative progressive disease characterized by progressive memory loss, and the accumulation of amyloid-β (Aβ) peptides is involved in AD pathogenesis. Astrocytes suffer changes under AD, presenting alterations in receptors, like adenosine A2A receptors (A2AR), and their signaling pathways. In astrocytes, cAMP and Ca2+ signals may arise following the activation of membrane G protein-coupled receptors (GPCRs), such as adenosine A2AR, that regulate key astrocytic functions, like activation of adenylyl cyclase (AC) and subsequent production of cAMP and glucose transport and metabolism. Thus, it is possible that AD-like conditions may cause changes in these functions.The major aims of this study were to: i) establish a new methodology for measuring intracellular cAMP levels in real-time using fluorescent proteins in cultured astrocytes; ii) evaluate the effect of cAMP dynamics and adenosine A2AR on glucose uptake, lactate exportation and G6Pase-β levels in cultured astrocytes under non pathological and AD-like conditions.To accomplish these aims, we used primary cultures of astrocytes and transfected them with different reagents and different plasmids (R-FlincA and Pink Flamindo). Transfected astrocytes were imaged in a fluorescence microscope and stimulated to elicit an increase in intracellular cAMP levels. To evaluate glucose and lactate transport, astrocytes were incubated with compounds that modulate AC, forskolin (FSK, AC activator), KH 7 (AC inhibitor) and with compounds that interfere with adenosine receptors: SCH 58261 (selective A2AR antagonist), CGS 21680 (selective A2AR agonist), and with the non-selective adenosine receptor antagonists, caffeine and theobromine, as well as with adenosine deaminase (ADA) that degrades extracellular adenosine. Noradrenaline, an agonist of GPCRs, and dbcAMP (cAMP analog) were also tested. We investigated if AD-like conditions (Aβ1-42 exposure) affect glucose and lactate transport and G6Pase-β levels, and if this impact was modulated by adenosine receptors. The glucose and lactate transports were assessed using enzymatic kit assays, whereas G6Pase-β levels were quantified by Western blot analysis.Although we could not transfect astrocytes in a reliable way to observe cAMP dynamics, we still took great strides to implement this methodology in the group for the future. Nevertheless, we gathered data showing that cultured astrocytes transfected with Pink Flamindo plasmids expressed cAMP sensor protein and maintained their excitability, as assessed by ATP evoked intracellular Ca2+ oscillations. Regarding our second aim: the data showed that FSK and KH 7 did not elicit significant changes in glucose uptake; caffeine and theobromine significantly (p<0.05) reduced glucose uptake, along with Aβ1-42; since SCH 58261 did not elicit significant changes, these data suggest that other adenosine receptors may be at play; ADA significantly reduced glucose uptake, supporting the involvement of an adenosine tonus, and consequently, adenosine receptors activation, in the regulation of glucose uptake; both CGS 21680 under AD-like conditions, and dbcAMP significantly (p<0.05 and 0.001) decreased the uptake of glucose, which is unexpected, considering that increased concentrations of cAMP should elicit an increase in glucose uptake, remaining to be clarified if this effect of CGS 21680 is related with the increased (p<0.05) G6Pase-β levels observed in CGS 21680-exposed astrocytes. In lactate exportation, no significant effects were obtained with adenosine A2AR modulation or Aβ1-42 exposure.Apart from contributing to establish a new methodology in our group to monitor cAMP oscillation in living cells, this study also provided evidences that adenosine receptors, in particular A2AR, as well as cAMP oscillations regulate the astrocytic uptake of glucose, which is crucial for maintaining the astrocytes energetic metabolism and, consequently, their functions. Astrocytic glucose uptake was also decreased by Aβ1-42 exposure, which might be related with the previously described adenosine A2AR upregulation observed in AD-like conditions.
Description: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10316/93942
Rights: embargoedAccess
Appears in Collections:UC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat Login
Tese_Rafael_Dias.pdf2.08 MBAdobe PDFEmbargo Access    Request a copy
Show full item record

Page view(s)

3
checked on Apr 9, 2021

Download(s)

1
checked on Apr 9, 2021

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons